龟板有效成分对小鼠毛囊生长和毛发生长周期的影响

钟淑贤　石雨晴　杨亚兰　申倩　胡佩欣　李春

[摘要]目的：观察龟板有效成分对脱发模型小鼠毛发生长及周期的影响。方法：制作小鼠休止期脱毛模型。脱毛后分组，其中阳性对照组予5%米诺地尔溶液、实验A、B、C组分别予0.15%、0.2%、0.4%龟板有效成分溶液外用于脱毛区。比较各组小鼠毛发生长差异，且在实验第19天切取小鼠背部脱毛区皮肤作HE染色及毛囊计数，观察龟板有效成分对毛囊数量的影响。结果：适当浓度的实验B组与阳性对照组的小鼠毛发生长优先于其他组;实验组小鼠毛囊毛干色素深，以终毛为主;实验组小鼠背部脱毛区皮肤毛囊数量比模型组多（P<0.05），有显著统计学意义。结论：龟板有效成分能促进毛发和毛囊生长，延长毛发生长期。

[关键词]龟板有效成分;休止期脱发;毛发生长;毛发周期;毛囊

[中图分类号]R329.2+8    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）10-0096-03

Abstract： Objective  To observe the effects of the effective components of tortoise shell on hair growth and cycle of hair loss model mice. Methods  The model of hair loss of telogen in mice was made. After depilation， positive control group were given 5% minoxidil solution and experimental group A， B， C were given 0.15%， 0.2%， 0.4% tortoise shell effective components solution respectively for the hair removal area. Comparison of hair growth differences between groups. The skin of the back hair of the mice was excised for HE staining and hair follicle count on the 19th day of the experiment， and the effect of the effective components of tortoise shell on the number of hair follicles was observed. Results  Appropriate concentration of experimental group B and positive control mice hair growth prior to other groups. The hair shaft colour of hair follicle of experimental mice were deep， which mainly were terminal hair. The number of hair follicles in the back depilation area of the experimental group was higher than that of the model group （P<0.05）， which was statistically significant. Conclusion  The effective components of tortoise shell promote the growth of hair and hair follicles and prolong the hair anagen.

Key words： effective components of tortoise shell; hair loss of telogen; hair growth; hair growth cycle; hair follicles

龟板味甘、咸、性寒，归肝、肾、心经，《本草纲目》记载“龟甲以补肾添精、补血滋阴为用”，具有补肾填精、滋阴潜阳、益肾健骨之功效。十四酸甾醇酯（Cholesterol Myristate， S8）和甾酮（（+）-Cholesten-3-one， S9）是龟板乙酸乙酯提取物中最具生物活性的单体[1]。课题组在前期研究中发现，龟板有效成分在促进大鼠伤口愈合的同时，促进了毛发的生长。基于肾“其华在发”理论，通过对肾脏的调理，本文探讨龟板有效成分对毛发的作用，旨在进一步深入研究龟板的功效。

1  材料和方法

1.1 实验动物：5～6周龄雄性C57BL/6J小鼠（SPF级），广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（粤）2018-0034。

1.2 主要试剂：米诺地尔购于上海易势化工有限公司，货号：RC503218;（+）-4-Cholesten-3-one（S9）购于Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.貨号：C1366。

1.3 方法

1.3.1 小鼠脱发模型建立：小鼠分笼饲养1周后，将松香和石蜡按1：1比例加热混合融化后，均匀涂抹于小鼠背部，面积为2cm×2cm，冷却凝固后揭去，以去除背毛。小鼠的皮肤在毛发生长期呈黑色，退行期呈灰色，休止期呈粉红色[2]。揭毛后确认毛发处于生长周期中的休止期，皮肤颜色为粉红色。

1.3.2 动物分组及干预：脱毛后，选取脱毛区皮肤光滑无皮损的小鼠，随机分为模型组6只、阳性对照组6只、实验A组6只，实验B组6只，实验C组6只。干预措施分别为：①模型组：造模不给药;②阳性对照组：造模后，给予5%米诺地尔外用，每天早上1次;③实验A组：造模后，给予0.15%龟板有效成分溶液外用;④实验B组：造模后，给予0.2%龟板有效成分溶液外用;⑤实验C组：造模后，给予0.4%龟板有效成分溶液外用，实验组给药早晚1次。连续给药19d。

1.3.3 观察记录结果：每天观察小鼠脱毛区皮肤颜色和毛发生长情况，并定期拍照。第19天，取各组小鼠背部脱毛区皮肤组织块，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行HE染色，光镜下观察，每张片在高倍镜下选取3个视野进行毛囊计数，每个视野尽量不重叠。

1.3.4 统计学分析：采用Stata/MP 13.1统计软件进行方差分析，两两比较的Bonferroni法分析数据，均数与标准差表示计量资料。

2  结果

2.1 不同浓度的龟板有效成分对毛发生长的影响：小鼠均在脱毛后第5～6天局部皮肤逐渐变黑，毛发进入生长期。第9天时，实验B组与阳性对照组已长出毛发。此外，第10天时，低、高浓度的实验A、C组的毛发生长速度明显落后于适当浓度的实验B组，甚至落后于毛发自然生长的模型组。各组小鼠毛发生长情况见图1。

2.2 组织学检查

2.2.1 实验第19天，切取每组小鼠背部皮肤，石蜡切片，HE染色进行观察：阳性对照组和实验组视野范围内毛囊数量明显比模型组多。实验组毛干色素深，以终毛为主，模型组与阳性对照组毛干色素浅甚至无，以毳毛为主。各组小鼠背部皮肤HE染色（400×）见图2。

2.2.2 龟板有效成分对毛囊数量的影响：实验第19天，各组小鼠毛囊数量见表1。按α=0.01水准，经方差分析，F=5.61，P=0.0023，P<0.01，差异有统计学意义，故模型组、阳性对照组和实验组涂抹的药物对毛囊数量的影响不完全相同。进一步进行两两比较，模型组与实验A组、实验B组、实验C组比较，P=0.015、P=0.005、P=0.011，均P<0.05，故模型组与实验组具有显著性差异，尤以实验B组差异最大。

3  讨论

龟板是一味补肾健骨的传统中药，具有促进成骨分化、保护神经系统、促进创伤修复等功能。研究表明，龟板提取物可能促进神经干细胞向多巴胺神经元分化[3];促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化[4];对多发性抽动症有良好的治疗作用[5];防治糖皮质激素诱导的骨量丢失、骨质量的损害及骨生物力学的减弱、骨形态的破坏和小梁骨表面破骨[6];还可能通过调控毛囊干细胞促进SD大鼠压疮创面修复[7]。目前国内外可见龟板对毛囊干细胞增殖影响的研究，未见龟板对毛发生长影响的相关报道。在正常的生理情况下，毛囊干细胞参与毛囊与毛发的再生。本研究以C57BL/6J小鼠为模型，设立模型组、阳性对照组和不同浓度的实验组，观察外用龟板提取物溶液对毛发生长、毛囊数量等影响。

米诺地尔溶液是临床应用极为广泛的一种治疗各类脱发的药物，它能够延长毛发生长期，缩短休止期，提高生长期/退行期的比例，舒张血管，增加局部血供，为毛囊提供更多的养分，促进毛发生长[8]。根据诊疗指南[9-10]，推薦男性患者使用5%米诺地尔，故本研究选用5%米诺地尔溶液为阳性对照。

本研究发现，实验B组与阳性对照组优先长出了毛发，低、高浓度的实验A、C组的毛发生长速度落后于适当浓度的实验B组，表明适当浓度的龟板有效成分可能与米诺地尔一样具有促进毛发生长作用。小鼠毛发呈黑色，皮肤中的黑素细胞均分布于毛囊，仅在毛发生长期才合成分泌黑素，并将黑素传递给角质形成细胞，使皮肤呈黑色，因此观察小鼠毛囊数量以及色素深浅是判断小鼠毛发生长状况的重要依据。从第19天小鼠背部皮肤HE染色和毛囊计数可观察到实验组毛囊数量普遍比模型组多，毛干色素深，以终毛为主，表明龟板有效成分能促进毛囊生长，使毛发持续处于生长期，延长毛发生长期。

本研究结果显示龟板有效成分能促进毛发和毛囊生长，延长毛发生长期，但由于人与动物有着种属差异，龟板有效成分是否具有促进人毛发生长作用还未知，此外其促毛发生长的机制也有待进一步研究。

[参考文献]

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[2]李云飞，林佩，贺嫣然，等.天然药物对毛发生长影响因素调节作用的研究进展[J].中草药，2014，45（11）：1655-1662.

[3]周笑莉，刘忆思，陈东风，等.龟板提取物调控Otx2基因促进神经干细胞向多巴胺神经元分化的研究[J].中药新药与临床药理，2017，28（2）：171-176.

[4]沈耿杨.龟板有效成分调节let-7f靶向TNFR2促BMSCs成骨分化的机制研究[C].中国中西医结合学会骨伤科学术年会，2017：2.

[5]方锦颖，陈琪，国文文，等.龟板对多发性抽动症模型大鼠的干预作用与对DA及D2受体的影响[J].环球中医药，2016，9（7）：781-784.

[6]任辉.龟板防治GIOP中miRNA调控Wnt/β-catenin通路的机理研究[D].广州：广州中医药大学，2017.

[7]李春，田瑞敏，李瑜，等.龟板提取物调控毛囊干细胞Wnt/BMP信号通路促进大鼠压疮修复[J].广州中医药大学学报，2019，36（1）：87-93.

[8]王璇，王瑾.雄激素源性脱发的机制及药物治疗进展[J].临床医药文献杂志，2018，5（33）：186-188.

[9]张建中.中国雄激素性秃发诊疗指南[J].临床皮肤科杂志，2014，43（3）：182-186.

[10]Motomu MANABE，Ryoji TSUBOI，Satoshi ITAMI，et al.Guidelines for the diagnosis and treatment of male-pattern and female-pattern hair loss，2017 version[J].J Dermatol，2018，45（9）：1-13.

[收稿日期]2019-03-25

本文引用格式：钟淑贤，石雨晴，杨亚兰，等.龟板有效成分对小鼠毛囊生长和毛发生长周期的影响[J].中国美容医学，2019，28（10）：96-98.