紫花地丁-白头翁配伍对小鼠溃疡性结肠炎的抗炎作用

2019-10-17 09:15薛观宏梁小瑞裴文刚熊科文邵永斌
中国畜牧杂志 2019年10期
关键词:紫花地丁白头翁溃疡性

薛观宏,罗 燕,梁小瑞,裴文刚,马 静,熊科文,邵永斌

(石河子大学动物科技学院,新疆石河子 832003)

溃疡性结肠炎即非特异性溃疡性结肠炎,是一种常见的慢性炎症性肠道疾病,主要累及结肠黏膜和结肠黏膜下层,呈连续性非节段性分布,临床上多表现为腹泻腹痛、黏液脓血便或便秘等症状,经常性发作,缠绵难退,给患者带来很大痛苦。溃疡性结肠炎发病机制复杂,在临床上除了手术以外,还未发现有效且方便的治疗方法。

紫花地丁和白头翁同属清热药。紫花地丁具有抑菌、抗炎、抗内毒素等功效。叶春芝[1]采用紫花地丁外敷内服相结合治疗蜂窝组织炎35 例,有效率为100%。赵丽娟[2]采用紫花地丁治疗扁桃体炎。庄淑萍[3]将紫花地丁及蒲公英捣烂外敷治疗腮腺炎。白头翁具有抗菌、抗炎、抗阿米巴原虫、抑制病原体、增强免疫功能等功效。陈旭东等[4]采用白头翁汤合槐花散治疗20 例家畜血痢,治愈率达100%。王永刚[5]采用白头翁汤治疗湿热蕴结证,患者症状基本消失,临床痊愈。闫港[6]配制中药散剂加味马齿苋白头翁散,治疗30 例仔猪白痢疾病,治愈率达91%。刘岩等[7]采用清热解毒法,在五味消毒饮的基础上加减治疗仔猪病毒性心肌炎,治愈率为90%。由紫花地丁、黄芩、乳香等五味中药组成的复方制剂,具有清热宣肺、化痰止咳等功效,效果显著。周押琴等[8]研究证实,白头翁加味汤对治疗溃疡性结肠炎效果优于柳氮磺胺吡啶肠溶片。然而,紫花地丁与白头翁配伍在治疗消化系统性疾病方面的研究较少。本试验旨在探究紫花地丁与白头翁配伍对小鼠溃疡性结肠炎的抗炎作用及其作用机制,为今后进一步研究溃疡性结肠炎的中药治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 从石河子市子午路大药房购买紫花地丁和白头翁,干燥至恒重。紫花地丁水煎剂:取紫花地丁200 g,用10 倍体积水浸泡30 min,加热煮沸后微沸30 min,趁热滤取药液;在药渣内继续加入8 倍量的水,煮沸后微沸30 min,滤取药液,合并2 次药液加热浓缩至400 mL。白头翁水煎剂:取白头翁200 g,药液制备过程同紫花地丁水煎剂,浓缩药液至400 mL。紫花地丁-白头翁配伍水煎剂:分别按1:1(紫花地丁100 g,白头翁100 g)、1:3(紫花地丁50 g,白头翁150 g)、3:1(紫花地丁150 g,白头翁50g)的比例称取药材,同前述方法制备药液并浓缩至400 mL。将所有制备完成的药液装于药液瓶内,-4℃低温保存备用。其他试剂包括柳氮磺胺吡啶肠溶片和右旋葡聚糖硫酸钠。

试验仪器包括恒温水浴锅(型号:HHW21.600AII,天津市泰斯特仪器有限公司);高速冷冻离心机(型号:Mu Itifuge XLR,美国赛默飞世尔科技有限公司);微量移液器(型号:Transferpette-s,TBRAND 德国普兰德);精密电子天平(型号:BS423S,北京赛多利斯仪器系统);自动制冰机(型号:IM-50,常熟市雪科电器有限公司)。BX41TF 光学显微镜:OLYMPUS;病理切片机:Leica RM2245;包理机:GE 1160;摊片机:Leica HI1220。

1.2 试验动物 SPF 级健康昆明小鼠80 只,6~8 周龄,体重18~22 g,雌雄各半。小鼠购入后饲养于(22±2)℃的动物房中适应性喂养7 d 后开展试验。

1.3 试验方法

1.3.1 造模 将适应性喂养后的80 只小鼠随机分成8 组,每组10 只,除空白对照组外,其余各组每天分别于10:00、14:00 和16:00 给予3%右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液定量灌胃,每次0.6 mL/20 g 体质量,连续7 d,建立溃疡性结肠炎模型,空白对照组灌服蒸馏水。造模期间每天观察小鼠饮食、毛发、一般活动状态等,出现稀便、腹泻、大便隐血或肉眼血便的任一症状即判定为模型建立成功,选取造模成功的小鼠平均分入各试验组。

1.3.2 分组及给药 试验共分为8 组,即空白对照组、模型组、阳性对照组、紫花地丁组、白头翁组、紫花地丁-白头翁(1:1)组、紫花地丁-白头翁(1:3)组、紫花地丁-白头翁(3:1)组。按照《实验动物和动物实验技术》中动物给药量计算:小鼠一日剂量=9.01×人的剂量(mg/kg);人标准体重按60 kg 算,常规中草药成人一日剂量按80 g计算,则小鼠一日用量为12 013 mg/kg,按上述方法计算出小鼠的一日剂量为240.26 mg(小鼠的标准体重按20 g 计算),将各中药水煎成浓度约为0.48 g/mL 的汤剂;同法,给予小鼠一日所需柳氮磺胺吡啶肠溶片的等效剂量为450.5 mg/kg,经研磨、溶解,配制成0.018 g/mL混悬液;空白对照组和模型组每日灌胃蒸馏水0.5 mL,阳性对照组每日灌胃柳氮磺胺吡啶肠溶片混悬液0.5 mL,各水煎剂每日灌胃0.5 mL,连续7 d。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 一般情况观察及疾病活动指数(DAI)评分 分别于给药第1、3、5、7 天称小鼠体重,并取各小鼠粪便,观察大便性状,粪便隐血试剂盒(邻甲苯胺法)测定大便隐血分数。根据文献标准对小鼠DAI 进行评分,DAI=(体重下降分数+大便性状分数+大便隐血分数)/3,评分标准见表1[9]。

表1 DAI 评分

1.4.2 结肠大体损伤指数(CMDI)评分 末次给药2 h后,断颈处死所有小鼠,剖开腹腔,取肛门至回盲部的结肠肠段,沿肠系膜缘纵行剖开,生理盐水冲洗干净,滤纸吸干多余水分并放置于白板上,放大镜观察各小鼠结肠的形态及大体损伤程度。评分标准见表2[10]。

表2 结肠大体损伤指数评分标准

1.4.3 结肠病理组织学指数(CHPI)评分 每只小鼠在距离肛门1 cm 处取远端结肠组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片、HE 染色,光镜下观察组织形态学改变,组织学损伤程度用炎症、病变深度、隐窝破坏与病变范围评分的乘积表示。评分标准见表3[11]。

1.4.4 结肠髓过氧化物酶(MPO)活性的测定 取2 cm结肠中下段,加9 倍结肠质量的生理盐水,充分匀浆,于4 ℃、10 000 r/min 离心15 min,取上清液,按照MPO 测试盒说明书,加入相应的试剂,进行MPO 活力测定。酶活力单位定义:每克组织湿片在37℃的反应体系中过氧化氢被分解为1 μmol 为1 个酶活力单位。MPO 活力=测定OD 值-对照OD 值/11.3×取样量(g)。

表3 病理组织学指数评分标准

1.5 统计分析 采用SPSS 25.0 统计软件对数据进行单因素方差分析,结果以平均值±标准差表示,组间采用方差分析,P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 症状 造模第5~6 天后,造模小鼠出现腹泻,食欲下降,被毛杂乱等症状;造模第6~7 天,造模小鼠出现不同程度肉眼可见的稀便,活动量明显减少,处于安静状态。对造模组死亡的小鼠进行剖检,发现结肠有肉眼可见的溃疡,造模成功。此时给小鼠分别给予不同比例配伍的紫花地丁与白头翁水煎剂进行干预,第1 天,症状恢复不明显,个别小鼠仍有软便,随后每天体重均有所增加,个别增加不明显,7 d 后,小鼠腹泻、稀便等症状明显减轻。

2.2 小鼠结肠组织学改变 由图1 可见,空白对照组小鼠结肠组织结构完整,腺体明显,未见萎缩、坏死、变性及炎性细胞浸润等现象。与空白对照组相比,模型组小鼠具有典型的溃疡性结肠炎病理变化。结肠组织结构破坏,出现溃疡,腺样异常,不典型增生,并伴有淋巴细胞增生,嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润,隐窝数量明显减少。与模型组相比,紫花地丁-白头翁(3:1)组,紫花地丁-白头翁(1:3)组和紫花地丁-白头翁(1:1)组隐窝数量均有所恢复,其中紫花地丁-白头翁(3:1)组隐窝数量较其他组恢复明显,隐窝炎症减轻,炎性细胞浸润程度轻。

2.3 各组小鼠一般情况观察及DAI、CMDI 以及CHPI评分结果由表2 可见,DAI 评分中,与空白对照组相比,紫花地丁-白头翁(1:3)组、紫花地丁-白头翁(1:1)组、白头翁组、紫花地丁组以及模型组差异显著,模型组差异极显著;试验组间,紫花地丁-白头翁(3:1)组与紫花地丁-白头翁(1:3)组、紫花地丁-白头翁(1:1)组以及紫花地丁组、白头翁组差异显著,紫花地丁-白头翁(3:1)组和模型组之间差异极显著。

图1 小鼠结肠病理组织切片(HE 染色,40×10)

CMDI 评分中,与空白对照组相比,模型组差异显著;试验组间,紫花地丁-白头翁(3:1)组和模型组之间差异显著,其余各组间差异不显著。CHPI 评分中,与空白对照组相比,紫花地丁-白头翁(1:1)组和模型组差异显著;紫花地丁-白头翁(3:1)组、紫花地丁-白头翁(1:3)组和模型组之间差异显著。

表2 小鼠DAI、CMDI 以及CHPI 评分结果

2.4 紫花地丁-白头翁配伍对小鼠MPO 活性的影响表3 结果显示,未给予任何药物治疗的模型组小鼠结肠组织的MPO 活性含量显著升高,与空白对照组相比差异极显著。给予各比例的紫花地丁与白头翁配伍的水煎剂后,各组小鼠结肠组织的MPO 活性均有所降低,其中紫花地丁-白头翁(3:1)组小鼠结肠组织的MPO 活性与模型组差异极显著。

表3 结肠MPO 活性测定结果

3 讨 论

3.1 紫花地丁与白头翁的有效成分及作用 紫花地丁的有效成分为软脂酸、对羟基苯甲酸、反式对羟基桂皮酸、丁二酸、二十四酰对羟基苯乙胺等,具有抗菌抗炎、抗内毒素、抗氧化等药理作用[12]。白头翁的有效成分为羽扇豆烷型皂苷和齐墩果烷型五环三萜皂苷[13],具有抗菌、抗炎、抗阿米巴原虫、抑制病原体、增强免疫功能等功效。实验室前期通过体内和体外试验进行了紫花地丁化学成分及其抗炎活性研究,结果显示,紫花地丁提取物具有显著的抗炎活性(未发表),为了研究紫花地丁在临床上的应用,采用复方形式与白头翁配伍,治疗临床上溃疡性结肠炎。

3.2 造模 DSS 诱导动物结肠炎是溃疡性结肠炎的动物模型,常用于结肠炎药理作用的研究,DSS 可破坏肠黏膜屏障,导致黏膜组织坏死,促进DSS 在通透性增加的结肠组织中扩散,从而加重炎症反应。该模型的建立简单方便,重现性好,便于实验的研究与筛选[14]。本试验以灌胃方式给予小鼠DSS 造模,造模第5~6 天后,造模小鼠出现腹泻,食欲下降,被毛杂乱等症状;造模第6~7 天,造模小鼠出现不同程度肉眼可见的稀便,活动量明显减少,精神沉郁,处于安静状态。

3.3 紫花地丁-白头翁配伍对小鼠溃疡性结肠炎的抗炎作用 溃疡性结肠炎以腹痛腹泻,粘液状血便为主要临床症状,DSS 诱导的小鼠表现精神沉郁,食欲不振,大便稀软,体重下降。本实验中,给予紫花地丁与白头翁配伍的水煎剂,可缓解溃疡性结肠炎小鼠粪便隐血程度以及疾病活动指数,紫花地丁-白头翁(3:1) 可显著改善溃疡性结肠炎小鼠血便程度及精神状况。通过组织病理学检查,紫花地丁-白头翁(3:1)明显减少结肠组织损伤范围,减轻炎性细胞的浸润程度,隐窝数量恢复明显。紫花地丁-白头翁(3:1)组与模型组的CHPI、CMDI 评分差异显著,表明紫花地丁-白头翁(3:1)可明显改善溃疡性结肠炎小鼠的临床表现。

在炎性反应初期常伴发浸润程度和炎性因子水平的升高,MPO 是中性粒细胞中含量较高的一种酶,该活性可反映出中性粒细胞的浸润数目和活性,因此,常通过测量MPO 活性作为对损伤部位炎症程度的评价指标。本试验结果表明,DSS 诱导的溃疡性结肠炎模型组小鼠MPO 活性明显升高,显示炎区中性粒细胞浸润,给予紫花地丁-白头翁(3:1)水煎剂干预后,小鼠结肠MPO 活性显著降低,表明该配伍比例可明显减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎炎症浸润程度及损伤程度。

综上,紫花地丁-白头翁(3:1)可减轻溃疡性结肠炎小鼠的临床症状,其机制可能与其抑制结肠中MPO活性有关。关于紫花地丁和白头翁配伍治疗溃疡性结肠炎的作用机制,还有待于进一步研究。

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