猪圆环病毒2型感染现状和免疫控制

王科文，曹海涛，刘忠行，郭海兵，杨丽梅，姚 晶，卢 悦，陈 萍[硕腾（上海）企业管理有限公司，上海 长宁 200050]

断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）首先发现于1991年的加拿大猪群，以消瘦、黄疸为特征（Clark，1996；Harding，1996），随后全球都有报道。之后陆续报道与PCV2相关的疾病有猪皮炎肾病综合征（PDNS）、繁殖系统疾病、呼吸道疾病和肠炎。所有这些疾病最初都称之为猪圆环病毒病（PCVD），这个命名在欧洲被广泛使用，但2006年10月，美国猪兽医协会（AASV）将其命名为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）。PCV2感染后可以表现为临床疾病，也可以为亚临床感染，感染后的损失来自于猪死亡率的增加、药物治疗成本的增加、兽医成本、生长缓慢猪的额外饲料以及更多的护理人员等。多数情况下，亚临床感染比临床疾病导致的经济损失明显高（Pablo等，2013）。目前该病是造成全世界养猪生产经济损失最严重的疾病之一。

1 我国猪群PCV2感染现状

1.1 血清学调查结果

硕腾猪病诊断实验室对2018年12月份至2019年5月份52家规模化猪场的4 384份血清样品，用ELISA方法调查了PCV2的抗体。所检测的所有猪场为PCV2抗体阳性，样本PCV2抗体总阳性率为61%，所有猪场不同阶段PCV2抗体总体阳性率见图1。通过各阶段阳性率可看出，在12周龄时的阳性率中位数/平均值都最低，随后逐渐上升。考虑到采样场大部分在14~21日龄免疫PCV2疫苗，可知生长猪群尽管都在免疫PCV2疫苗，但大部分生长猪群PCV2仍然在12周龄以后循环，虽然观察到的临床PCVAD案例不多，但多呈亚临床感染，和美国猪群类似。

图1 52个猪场各阶段PCV2抗体总体阳性率

1.2 qPCR调查结果

为进一步了解PCV2在猪群循环的阶段和强度，选择了上述血清学调查中的10个场做PCV2循环阶段和强度评估，这10个猪场都是在10周龄后PCV2抗体阳性率有明显上升的。每个场分别取4、10、16、20周龄等4个阶段血样进行qPCR检测，每阶段检测5份（其中1个场只检测4份），结果如表1。由表1知，10周龄以后，阳性场数和阳性样品数都大幅上升，到20周龄时，全部猪场都为PCV2抗原阳性，总体样本阳性比例也达到33/49。综合表1和10个场各阶段的抗原阳性率及抗原拷贝数变化可知（图2和图3），猪场感染PCV2主要发生在10周龄和20周龄之间。

表1 10个猪场在4个周龄段的PCV2 qPCR检测结果

图2 10个猪场4个周龄段PCV2抗原阳性率

图3 10个猪场4个周龄段PCV2拷贝数分布（log10）

由上述PCV2抗体和抗原调查结果可知，PCV2仍然在目前大多数生长猪群12周龄以后循环，少数猪群在保育期，甚至哺乳期阶段即存在PCV2感染。

2 免疫控制

2.1 瑞圆安®疫苗简介

众多研究表明，PCV2疫苗的免疫可显著减少PCVAD的发生，减少血清和组织中PCV2载量，减少PCV2的传播，提高猪群的生产水平。目前常见猪圆环病毒疫苗有PCV2病毒灭活苗、PCV1-2嵌合体病毒灭活苗和PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗。瑞圆安®为全球首创的PCV1-2嵌合体灭活疫苗，由灭活的PCV1-2病毒（图4）和SLCD水包油佐剂组成。

PCV1-2病毒具有PCV1的良好复制能力，又保留了PCV2中保护性抗原表位的良好空间构像，灭活后具有优秀的免疫原性（灭活剂为BPL，β-丙内酯，常用于狂犬病疫苗的灭活，对病毒既有很强的灭活效果，又能保留病毒很好的免疫原性）。SLCD水包油佐剂通过促进抗原递呈等多个途径参与疫苗免疫后的免疫应答，从而进一步提高瑞圆安®的细胞免疫和体液免疫水平，延长免疫保护期。体液免疫在阻止PCV2感染、吸附和侵入细胞起到重要作用；细胞免疫有助于感染细胞的清除和提供长期的保护（甚至中和抗体消失的情况下），保守的T细胞表位的细胞介导免疫能提供广泛的保护。

图4 瑞圆安®的抗原—嵌合体PCV1-2病毒

2.2 接种瑞圆安®后的免疫反应

Hwi Won等（2014）通过比较4种PCV2商品化疫苗免疫3周龄PRRSV（蓝耳病病毒）、Mhp（肺炎支原体）、PCV2（圆环病毒2型）阴性仔猪的多项免疫指标，揭示了PCV2疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫发展规律。由图5可知，无论PCV2病毒灭活苗、PCV1-2嵌合体灭活苗，还是亚单位苗，免疫后PCV2特异性 γ-干扰素分泌细胞（IFN-γ-SC）都是在免疫后21天达到最高水平，然后逐渐降低，直到免疫后154天仍能被检测到。而由图6知，这3种疫苗免疫后中和抗体都是42天达到高峰（试验中用的中和病毒属于PCV2b），能维持到免疫后至少154天。

当然，由图5和图6可知，瑞圆安®与另一个全病毒灭活苗IFN-γ-SC和中和抗体最高值都显著优于其他两个亚单位疫苗，这可能与全病毒疫苗具有更好的免疫原性有关。

图5 4种商用疫苗接种后不同时间PCV-2特异性γ-干扰素分泌细胞（IFN-γ-SC）数量的平均值及标准差

图6 4种商用疫苗接种后不同时间中和抗体水平（NA）均值和标准差

2.3 瑞圆安®的免疫效力

众多的研究证实瑞圆安®具有优秀的免疫效力。Neill等（2011）比较了瑞圆安®和亚单位PCV2疫苗在5日龄和21日龄时免疫PCV2双阴猪，然后在49日龄用PPV（细小病毒）、PCV2、PRRSV攻毒后的效果，结果表明，两个疫苗免疫后都能显著降低攻毒后病毒血症、病毒载量和淋巴病变，但瑞圆安®在21天免疫能提供更好的保护（表2、表3）。

表2 不同组别圆环病毒49日龄攻毒后的圆环病毒检出率和病毒DNA数量

表3 用免疫组化方法测淋巴组织中圆环病毒检出率和淋巴病变指数

Hwi Won等（2013）研究了PCV2疫苗对公猪的保护效果。试验把25头8月龄的纯种PCV2、PRRSV抗原抗体阴性公猪分为5组，第1～3组分别免疫瑞圆安®、PCV2灭活苗A和PCV2亚单位苗B，第4、5组注射PBS作对照。免疫后21天第1～4组用3毫升/头PCV2b攻毒（毒株为SNUVR000463；第5代；含毒量为104.5TCID50/毫升）。然后分别从免疫后ELISA抗体值（图7）、攻毒后血清和精液中病毒载量的变化（图8和图9）等方面对疫苗保护效力进行了评估。结果显示，在攻毒后第0、7、14、21天免疫组PCV2抗体水平显著高于未免疫组；攻毒后14、21天免疫瑞圆安®组的血清中病毒载量显著低于其他免疫组；攻毒后21、28天免疫瑞圆安®组的精液中病毒载量显著低于其他免疫组。

图7 3种商用疫苗免疫后不同时间PCV2 ELISA抗体值的变化

图8 3种商品疫苗攻毒后不同时间血清中PCV2b的DNA载量变化

图9 3种商品疫苗攻毒后不同时间每毫升精液PCV2b基因拷贝数

Hwi Won（2012）在3个猪场用瑞圆安®做了田间免疫试验，发现瑞圆安®免疫组日增重显著高于未免疫组，上市日龄缩短了5～7天，死亡率、淋巴病变、PCV2免疫组化指数也都显著降低（表4）。

表4 3个猪场免疫组和未免组平均日增重、死亡率、淋巴病变指数和圆环病毒抗原免疫组化指数对比

综上研究知，瑞圆安®免疫后，PCV2特异性γ-干扰素分泌细胞和中和抗体水平都比其他疫苗要高；实验室攻毒后，免疫瑞圆安®组血液和精液中病毒载量明显降低；田间试验中，对提高日增重、降低死亡率，减少淋巴病变都有显著效果。

2.4 免疫程序的制定

2.4.1 生长猪免疫程序的制定 对生长猪而言，要制定合理的免疫程序，需综合考虑母源抗体的影响、疫苗免疫后产生有效免疫力的时间（由上文Hwi Won等的研究可知，PCV2疫苗免疫后细胞介导的免疫21天后达到高峰，体液免疫42天后达到高峰），以及PCV2在猪群中实际循环的大约时间。

多个研究发现母源抗体对仔猪接种PCV2疫苗后的免疫反应有干扰，甚至发现21日龄免疫时的母源抗体滴度和其免疫后28天的抗体滴度呈负相关（Yeonsu等，2014）。Fort等（2009）进一步研究发现，具有母源抗体过氧化酶单层免疫试验（IPMA）抗体值10.6 log2（或中和抗体NA＞8log2）的猪，能够完全抵抗口鼻接种105TCID50/毫升（不产生病毒血症），而低于IPMA 5.5 log2（或NA＜3.9 Log2）则会更易感。该研究同时发现，母源抗体IPMA≥10 log2（或NA≥8.8 log2）看起来会干扰免疫后的体液免疫反应，而IPMA＜8 log2（或NA＜5.5 log2）则不会。考虑到酶联免疫吸附试验（ELISA）和IPMA抗体相关性的研究结果（Pireri等，2014；基于 Synbiotics ELISA 试剂盒，见图10），为避免母源抗体的干扰，免疫时机可在ELISA母源抗体值在400～650之间进行（基于Synbiotics ELISA试剂盒）。硕腾猪病诊断实验室在2019年1—3月份期间，对来自不同免疫程序母猪的600头21日龄仔猪的母源抗体用Synbiotics ELISA试剂盒进行了调查，得到的相应平均母源抗体水平，以及我们根据不同母源抗体水平推荐的生长猪大体免疫时机见表5。

图10 ELISA抗体值和IPMA滴度的相关性（基于Synbiotics ELISA试剂盒）

表5 不同免疫程序母猪的仔猪调查数量、21日龄平均ELISA抗体滴度和建议大体免疫时机

实际生产中，母猪免疫程序相同的猪场间的母源抗体也有差异。为了解其后代免疫前的母源抗体的真实水平，可在免疫前某个时间点采10～15个血样，检测ELISA抗体，然后结合母源抗体的半衰期（大约为15天），来推算免疫前某个时间的大体母源抗体水平。

为进一步优化生长猪的免疫程序，需了解生长猪群中PCV2循环的具体阶段和强度。生长猪群中PCV2循环阶段和强度可通过在4周龄、8周龄、12周龄、20周龄等4个阶段各采15个血清样本，每3份样本合成1份样本进行qPCR检测。表6为根据各阶段qPCR检测结果优化的免疫程序。

表6 根据PCV2病毒循环时间优化过的推荐接种时间

实际中PCV2感染多发生在5~15周龄，PCV2疫苗接种时间多在1至11周龄进行。免疫日龄最好是母源抗体最小，并在PCV2自然感染之前至少3周。另外，需要提到的是PCV2疫苗免疫2次往往优于1次（Maria等，2008）；在感染PCV2以后免疫PCV2疫苗，接受PCV2攻毒后，仍能显著降低PCV2的病毒血症（Shen等，2010）。

2.4.2 种猪免疫程序制定 研究表明PCV2灭活苗免疫母猪以后，其初乳中具有产生PCV2特异性γ-干扰素的T细胞，并能通过小肠进入体内（Goubier等，2009），其后代PCV2特异性γ-干扰素分泌细胞显著高，攻毒后淋巴病变免疫组也显著低（Yeonsu等，2012）。进一步的研究表明，免疫母猪的后代的生长性能优于未免疫的后代（Kurmann等，2011），母猪、仔猪都免疫优于其它的免疫程序（Fraile等，2015）。

对于有PCV2感染压力，特别是在其后代通过上文采样和qPCR检测，发现PCV2在8周龄前有循环，以及有PCV2相关繁殖障碍的猪场，母猪群应免疫2~3次/年，1头份/次。目前PCV2感染背景的情况下，后备母猪应在第1次配种前至少30天完成2次接种（2次间隔1个月，多在22周龄、26周龄各接种1次），1头份/次。

如2.3中所述，公猪免疫后再接触PCV2野毒，血清、精液中病毒载量显著下降。建议公猪群免疫瑞圆安®2~3次/年，1头份/次。

3 总结

猪圆环病毒广泛存在，由于猪圆环病毒疫苗的普遍使用，猪圆环病毒病已经很大程度得到控制，但大多数猪场PCV2仍然在生长猪群12周龄以后循环，少数的猪场在保育期甚至哺乳期就感染PCV2。选择高效、稳定的PCV2疫苗—“瑞圆安®”，综合考虑母源抗体水平的衰减、免疫后产生免疫力需要的时间以及病毒循环的时间，制定科学的免疫程序是控制PCVAD最简单可行的方法。