17味藏药粗提取物对仔猪细菌性腹泻主要病原菌体外抑菌试验

谢 晶，曹 冶，李 琰，殷明郁，于吉峰，李兴玉，康润敏，张金灵

（四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

仔猪腹泻是集约化养猪生产条件下的一种典型的多因素性疾病，对仔猪成活率和后期增重都具有严重影响，是目前最为严重的仔猪疾病之一[1-2]。仔猪腹泻发病机理复杂，常表现为交叉混合感染，导致临床诊断与防治困难，为养猪业造成巨大的经济损失。产肠毒素大肠埃希氏菌（EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC）是导致仔猪腹泻发生的主要病原菌，在我国大约有35%的病例由ETEC引起，部分仔猪会继发感染沙门氏菌[3-8]。目前在生产中主要使用抗生素对仔猪腹泻进行预防和治疗，但由于抗生素的滥用，不仅使得病原微生物产生耐药性，降低药物疗效，而且，这些药物大量使用会造成畜产品中药物残留，严重威胁人类健康。因此，以天然中草药为原材料或以中草药与西药相结合来防治仔猪腹泻日益受到重视[9-11]，藏药作为我国传统中草药的一个重要组成部分，具有很好的研究价值和开发前景。本研究选择17味藏药对仔猪细菌性腹泻主要病原菌产肠毒素大肠埃希氏菌、猪霍乱沙门氏菌进行体外抑菌试验，利用琼脂扩散法和试管二倍稀释法筛选出对仔猪细菌性腹泻敏感的藏药，为仔猪细菌性腹泻藏药防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2017年8月至2018年8月在四川省畜牧科学研究院兽医研究所实验室进行。

1.2 菌株

产肠毒素大肠埃希氏菌BNCC186736和猪霍乱沙门氏菌CVCC3383为标准株，分别购自北纳创联生物有限公司和中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.3 藏药

选择矮紫堇、波棱瓜子、乌奴龙胆、多刺绿绒蒿、余甘子、螃蟹甲、宽解藤、茜草、翼首草、狼毒、千里光、甘松、虎耳草、诃子、刺柏、藏木香、无患子共17味藏药，作为本次研究所用药物，全部药物购自成都市荷花池中药材专业批发市场。

1.4 主要试剂

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基购自四川达文西科技有限公司，Mueller-Hinton琼脂购自OIOID LTD。

1.5 菌液的制备及计数

菌种复苏，接种于营养琼脂培养基，37℃恒温培养箱中培养24 h，挑取菌落接种于营养肉汤培养基中，37℃震荡培养12 h。

1.6 藏药提取的制备

将已筛选17味藏药经粉碎至粗粉，分别制备水提取物和乙醇提取物，用于体外抑菌作用研究。1.6.1水粗提取物的制备 称取各藏药生药粉末100 g，用滤纸包好后放入索氏抽提器中，加入中性去离子水索氏提取5 h，回收水提取物，在水浴锅上浓缩并定容，即得水粗提取物，最终浓缩液的药物浓度见表1，无菌分装后放入-20℃冰箱备用。药物编号X-1。

1.6.2 乙醇粗提取物的制备 称取各藏药粗粉100 g，用滤纸包好后，放入索氏抽提器中，加入无水乙醇索氏提取6 h，回收乙醇提取物，在水浴锅上浓缩并定容，最终浓缩液的药物浓度见表1，紫外线照射灭菌获得乙醇粗提取物，无菌分装后放入-20℃冰箱备用。药物编号X-2。

1.7 单味藏药粗提取物药物敏感性试验

参照YY-T 1191-2011抗菌剂药敏纸片法进行药敏试验。将纸片滴加20 μL提取液，无菌烘干备用。培养基采用Mueller-Hinton琼脂。将培养菌液用无菌生理盐水稀释至0.5个麦氏单位菌悬液。用无菌棉拭蘸取稀释过的菌液，均匀涂布整块琼脂培养基表面，室温3～5 min后，贴加含药纸片，置于35℃恒温培养箱培养16～18 h，测定其纸片周围抑菌环直径的大小3次，计算其平均值即为试验结果。

1.8 单味藏药粗提取物药物最小抑菌浓度（MIC）测定

粗提取物蒸干称重后定容，计算粗提取物浓度，采用试管二倍稀释法进行，确定中药最小抑菌浓度（MIC）。取无菌的试管9支进行编号，除第1管加入1～1.5 mL MH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1 mL，在第1管加入提取物原液0.5～1 mL，终体积为2 mL，混匀，然后吸取1 mL至第2管，混匀后再吸取1 mL至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取1 mL弃去，第9管为不含药物的生长对照。之后在每管内加入上述制备好的接种物各1 mL，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/mL。置35℃普通空气孵箱中孵育24 h。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。

2 结果

2.1 藏药粗提取物生药浓度

将17味藏药粉碎，进行水提取、乙醇提取，浓缩获得粗提取物，并计算生药浓度，各藏药粗提取物生药浓度见表1。

表1 藏药粗提取物生药浓度 g/mL

2.2 单味藏药粗提取物药物敏感性试验结果

测定结果显示，产肠毒素大肠埃希氏菌标准株BNCC186736对乌奴龙胆、多刺绿绒蒿、余甘子、螃蟹甲、宽解藤、狼毒、甘松、诃子8味药物敏感。其中，余甘子的水粗提取物和乙醇粗提取物都有显著的抑菌效果；诃子的水粗提取物有显著的抑菌效果，而醇粗提取物没有抑菌效果；乌奴龙胆、多刺绿绒蒿、螃蟹甲、宽解藤、狼毒、甘松的乙醇粗提取物有显著的抑菌效果，而水粗提取物没有抑菌效果。猪霍乱沙门氏菌标准株CVCC3383对多刺绿绒蒿、余甘子、螃蟹甲、诃子4味药物敏感。其中，多刺绿绒蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物有显著的抑菌效果，而水粗提取物没有抑菌效果；余甘子、诃子的水粗提取物有显著的抑菌效果，而乙醇粗提取物没有抑菌效果。结果见表2。

表2 单味藏药药物敏感性试验结果 mm

2.3 单味中药最小抑菌浓度（MIC）测定结果

选取对产肠毒素大肠埃希氏菌标准株BNCC 186736和猪霍乱沙门氏菌标准株CVCC3383均有抑菌效果的藏药余甘子、诃子水粗提取物和多刺绿绒蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物，测定最小抑菌浓度，测定结果显示，余甘子、诃子的水粗提取物对产肠毒素大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌的抑菌效果最好，两味藏药的最小抑菌浓度分别为1.516 mg/mL和6.065 mg/mL；多刺绿绒蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物对产肠毒素大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌也具有较好的抑菌效果，两味藏药的最小抑菌浓度分别为41.333 mg/mL和94.302 mg/mL。结果见表3。

表3 单味藏药最小抑菌浓度（MIC）测定结果 mg/mL

3 讨论

藏药是我国传统医药学宝库的一个重要组成部分，传统藏药中有许多具有治疗细菌性感染性疾病的功效[13]。目前临床治疗中抗生素耐药性菌株的增多以及化学药物的副作用，使得从天然药物中分离筛选新的抗菌药物成为趋势和热点。

本研究选取矮紫堇、波棱瓜子、乌奴龙胆、多刺绿绒蒿等17味藏药均具有清热解毒抗感染的作用，体外抑菌试验结果显示，乌奴龙胆、多刺绿绒蒿、余甘子、螃蟹甲、宽解藤等8味藏药具有较好的抑菌效果，矮紫堇、波棱瓜子、虎耳草等9味藏药未表现出较强的抑菌活性。在具有抑菌效果的8味藏药中，除诃子外的7味藏药的乙醇粗提取物均具有抑菌活性；而仅有余甘子、诃子2味藏药的水粗提取物具有抑菌活性。从中筛选出对仔猪细菌性腹泻主要病原菌产肠毒素大肠埃希氏菌、猪霍乱沙门氏菌均有抑菌作用的藏药4味，分别为余甘子、诃子、多刺绿绒蒿和螃蟹甲，其中又以余甘子、诃子的水粗提取物的抑菌效果最好，为仔猪细菌性腹泻藏药防治提供理论基础。

余甘子是大戟科叶下珠属植物余甘子的果实，在藏药、蒙药、维药、彝药等中都有广泛应用。余甘子含有多种维生素、微量元素、氨基酸、有机酸、蛋白质、糖类等[14]，研究表明余甘子提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鼠沙门氏菌、霍乱弧菌、大肠埃希氏菌等均有抑菌活性，抗菌谱较广[15-17]。本试验结果同样显示，余甘子的乙醇粗提取物和水粗提取物都有显著的抑菌效果。其乙醇粗提取物对产肠毒素大肠埃希氏菌具有抑菌作用，水粗提取物对产肠毒素大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌均有抑菌作用，且抑菌效果最好，最小抑菌浓度为1.516 mg/mL。

诃子是使君子科榄仁树属植物诃子及其变种绒毛诃子的干燥成熟果实，在我国民间用药较广泛，在藏药中有“药中之王”之称[18]。诃子化学成分丰富，含鞣质类、酚酸类、三萜类、黄酮类、挥发油等，研究表明诃子提取物对产气荚膜梭菌、大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌均有显著的抑菌效果[18-20]。本试验结果显示，诃子的水粗提取物对产肠毒素大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌均有较强的抑菌作用，最小抑菌浓度为6.065 mg/mL。

多刺绿绒蒿是罂粟科绿绒蒿属多刺绿绒蒿的全草，为藏医习用药，具有清热止痛、活血化瘀等功效[21-22]。现代研究表明多刺绿绒蒿含有生物碱、黄酮、萜类等成分，其中的血根碱的酸性硫酸盐、桂皮酸、白屈菜红碱等成分对某些细菌具有显著的抑制作用[23]，但少见多刺绿绒蒿提取物抑菌效果的研究报道。本试验结果显示，多刺绿绒蒿的乙醇粗提取物对产肠毒素大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌均有抑菌作用，最小抑菌浓度为41.333 mg/mL。

螃蟹甲是唇形科糙苏属多年生草本植物螃蟹甲的干燥块根，是藏医常用传统藏药。螃蟹甲主要含有环烯醚萜苷类、呋喃拉布素型二萜类、黄酮类、苯乙醇苷类、挥发油类等化合物，具有祛风活络、强筋壮骨、清热消肿、止咳祛痰、抗感染等作用[24-25]。研究表明，螃蟹甲提取物对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌作用[13，26]。本试验结果显示，螃蟹甲的乙醇粗提取物对产肠毒素大肠埃希氏菌和猪霍乱沙门氏菌均有抑菌作用，最小抑菌浓度为94.302 mg/mL。