全反式维甲酸对大肠癌LoVo细胞增殖、迁移能力的影响

葛宝健 王倩

摘要：目的 探討全反式维甲酸（ATRA）对大肠癌LoVo细胞增殖和迁移能力的影响。方法  MTT法检测ATRA作用于LoVo细胞48h后的生长抑制率及IC50;划痕实验观察ATRA对LoVo细胞迁移能力的影响。结果 ATRA对LoVo细胞的IC50=4.493?g/ml，且呈现浓度依赖性抑制LoVo细胞增殖;ATRA可明显抑制LoVo细胞的迁移能力，且呈浓度依赖性。结论 全反式维甲酸（ATRA）能够显著抑制大肠癌LoVo细胞的增殖和迁移能力。

关键词： 全反式维甲酸;大肠癌;增殖;迁移

【中图分类号】R574.6    【文献标识码】A    【文章编号】2107-2306（2019）04-070-02

大肠癌占消化系统肿瘤疾病的第二位，全球每年有大约60万患者死亡，其中男性患病机率高于女性。当前临床治疗主要以手术为主，辅以放疗和化疗，但患者的术后5年总生存率仅50%左右，而术后发生转移、复发的患者5年生存率仅为19%^[1-2]。因此，寻找有效的抗肿瘤转移药物，已经迫在眉睫。 全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）是维生素A的一种衍生物，目前已经广泛应用于皮肤科疾病的治疗。现有研究证实，ATRA不仅对皮肤病有效，对多种恶性肿瘤如白血病、黑色素瘤、肝癌等都有抑制作用^[3]。本实验通过检测ATRA的适药浓度以及抑癌效果，探究其对大肠癌LoVo细胞增殖和迁移能力的影响，为其参与大肠癌疾病的治疗提供依据。

1、材料与方法

1.1 材料

人大肠癌细胞系LoVo细胞由大连医科大学生化实验室提供。ATRA、MTT、DMSO（Sigma 公司），RMPI-1640培养液、胎牛血清（HyClone公司），胰酶、青链霉素（Gibco公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药物准备

细胞培养于RPMI-1640 培养液（含体积分数10% 胎牛血清）， 37℃、5%CO2、湿度100%，培养至对数生长期。5mg ATRA，用DMSO配成5mg/ml浓度药物母液，分装于EP管，-20℃冰箱避光贮存。使用时，用RPMI-1640培养液稀释。

1.2.2 MTT检测ATRA 对LoVo 细胞的生长抑制率

96孔板接种细胞8000个/孔，设置空白组（培养液）、对照组（细胞）及药物组（细胞+ATRA：0，0.625，1.25，2.5，5，10，20?g/ml），每组6个复孔，培养48h后，酶标仪492nm 处测吸光度（OD值），计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=[1-（药物组-空白组OD值）/（对照组-空白组）]×100%，筛选用药浓度进行后续实验。

1.2.3划痕试验检测ATRA 对LoVo细胞的迁移影响

6孔板接种细胞2×10⁵个/孔，设对照组和药物组（2.5，5，10?g/ml），培养细胞密度至80%时，用无菌枪头划痕，PBS洗涤细胞3次，拍照记录初始划痕间距（A0），培养48 h后，再次拍照统计相同位置划痕间距（A48）。细胞迁移率=（A0-A48）/A0 × 100%。

1.2.4 统计学处理

应用GraphPad Prism 6.0 软件处理实验数据，各实验均独立重复3次。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 ATRA对LoVo细胞增殖作用的影响

ATRA对LoVo细胞的抑制率随着浓度升高而增高，呈现明显的浓度依赖性，且差异均具有统计学意义（P<0.01），筛选半抑制药物浓度（IC50）为4.493?g/ml（图1）。以IC50为标准选取2.5、5、10 ?g/ml三个浓度作为后续实验浓度。

2.2 ATRA对LoVo细胞迁移能力的影响

ATRA处理LoVo细胞48 h后，各组细胞划痕间距均变窄，对照组细胞划痕接近消失，药物组药物浓度越高，划痕区细胞数量越少（图2）。四组细胞迁移率分别为70%、25%、14%、9%（48h），药物组与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01）（图3），提示ATRA能抑制LoVo细胞的迁移，且具有浓度依赖性。

3、讨论

大肠癌细胞转移是目前临床癌症患者术后死亡率提高的一个重要因素，而肿瘤转移的过程涉及肿瘤细胞黏附、迁移以及肿瘤微环境变化等多个环节^[4]，如何抑制肿瘤的侵袭和转移过程已经成为目前的研究热点。本实验全反式维甲酸（ATRA）作用LoVo细胞的结果显示：ATRA抑制LoVo细胞的增殖的迁移过程，且呈现明显的浓度依赖性。本实验中，ATRA对LoVo细胞的迁移能力也具有显著地抑制效果，浓度越高，抑制作用越强，但5?g/ml与10?g/ml的抑制率相比，差异无统计学意义，5?g/ml的药物剂量也进一步验证了前期实验得出的半剂量药物浓度（IC50=4.493?g/ml）的准确性，临床上长时间和大剂量的用药会严重增加耐药性和毒副作用，此结果具有指导意义，可作为后续实验用药基础。

综上所述，ATRA对大肠癌LoVo细胞的增殖和迁移具有良好的抑制作用，但其引起细胞凋亡的信号传导途径及其作用机制仍有待进一步研究，为应用ATRA临床治疗大肠癌提供依据。

参考文献

[1] BURGERS K，MOORE C，BEDNASH L. Cancer of thecolorectal cancer survivor[J]. Am Fam Phisician，2018，97.

[2] LUCCHETTI D，CALAPA F，PALMIERI V，et al. Differentiation affects the release of exosomes from colon cancer cells and their ability to modulate the behavior of recipient cells[J]. Am J Pathol，2017，187（7）：1633-1647.

[3] Alizadeh F，Bolhassani A，Khavari A，et al.Retinoids and their biological effects against cancer.Int Immunopharmacol，2014，18（ 1） ： 43-49.

[4] Forner A，Reig M，Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet，2018，391（10127）：1301-1314.