杭椒新品种H12纯度的SSR快速鉴定技术

傅鸿妃

(杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

辣椒是我国重要的蔬菜作物，目前全国辣椒种植面积超过200万hm2，占蔬菜种植面积的12%，产量4 000万t，是全球辣椒生产第一国[1]。辣椒是常异花授粉蔬菜，杂交种子生产绝大部分通过人工去雄后再授粉得到，因此，在生产过程中容易产生因去雄不干净而造成自花授粉，昆虫传播和机械混杂也是导致花粉混杂的原因。杂交种子纯度鉴定是保证种子质量和农民效益的有效手段，对于提高生产效益和利用杂种优势具有非常重要的意义。

目前，我国杂交种子纯度鉴定以田间栽培形态鉴定、实验室同工酶电泳鉴定和分子标记鉴定为主。田间种植鉴定周期较长，需要花费大量的劳动力和土地资源，且易受到环境因素的影响。同工酶鉴定多态性信息相对较少，又具有组织器官特异性，随着新品种数量的不断增加和种质遗传基础越来越狭窄，这2种鉴定方法已经难以满足纯度鉴定的精确性要求。分子标记技术因快速、精确性高等原因被越来越多地应用在杂交种子纯度鉴定上，SSR分子标记具有操作方法简单、标记数量丰富、多态性稳定性和重复性好、条带分布均匀等优点，本实验利用该技术对杭椒杂交种子进行快速鉴定，以期可以有效加快种子鉴定速度，节约时间和成本。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用材料是课题组自留的自交提纯辣椒品种H12母本、H12父本和杂交种H12。3份材料在当年11月份播种，于次年3月中下旬定植于杭州市农业科学研究院蔬菜基地。

1.2 DNA的提取与检测

采用改良的CTAB法提取样品心叶基因组DNA，用分光光度计NanoDrop2000检测DNA质量和浓度，-20 ℃下保存备用。

1.3 PCR扩增体系和扩增程序

PCR扩增体系为总体积25 mL，其中10×PCR缓冲液2.5 mL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 mL，SSR左右引物(10 mmol·L-1)各2.0 mL，Taq酶(5 U·mL-1)0.5 mL，模板DNA(25 ng·mL-1)2.0 mL，ddH2O 14.0 mL。

SSR-PCR扩增程序为94 ℃预变性60 s；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸3 min。扩增产物30%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，快速银染法染色。

1.4 引物的合成与筛选

参照发表的文献和数据库查找得到辣椒的SSR引物，经辣椒SSR遗传多样性研究选出多态性较好引物31对[2]，用于区分杭椒父母亲本和杂交种，引物由上海生物生工公司合成。

1.5 杂交种SSR纯度鉴定

将选出的能区分父母亲本和杂交种的引物，用于杂交种的纯度鉴定，杂交种纯度(%)=同时具备父母亲本特征条带的植株数量/检测的植株总数量×100%。

1.6 杂交种田间纯度鉴定

定植后的杂交种植株进行常规田间管理，统计之前不去杂、不间苗。盛花期统计总株数和杂株数，统计杂交种田间纯度，杂交种纯度(%)=(总株数-杂株数)/总株数×100%。

2 结果与分析

2.1 提取的DNA质量分析

SSR标记的质量与DNA的质量息息相关，DNA纯度用D260/D280值估算，D260/D280值为1.8的DNA质量很好，是纯品。分光光度计NanoDrop2000测量得到H12母本辣椒、H12父本辣椒和杂交种H12辣椒的DNAD260/D280值分别为1.99、1.87和1.75，满足SSR分子标记的需要。

2.2 SSR引物筛选

利用H12母本辣椒、H12父本辣椒和杂交种H12辣椒，以31对引物进行多态性挑选，31对引物均扩增出了清晰条带，但大部分不能区分父母本辣椒和F1代杂交种，不适合用于父母亲本与F1代杂交种的纯度鉴定，只有Cams885和GP20036两对引物在父母亲本和杂交种之间扩增出典型的父母本互补条带，可用于鉴定父母亲本和F1代杂交种。图1、图2是在引物Cams885和GP20036下扩增出的区分H12和父母亲本的图谱。

a—母本；b—父本；c—H12。图2同。图1 引物Cams885区分H12和父母亲本的图谱

图2 引物GP20036区分H12和父母亲本的图谱

2.3 杂交种SSR纯度鉴定

分别取96株H12植株的心叶，利用引物Cams885和GP20036进行纯度鉴定，结果发现96个H12植株中引物Cams885扩增出92个植株条带清晰一致，引物GP20036扩增出86个植株条带清晰一致，利用这2个引物检测杂交种H12种子的纯度分别是95.8%和89.6%。图3、图4分别是杂交种H12在引物Cams885和GP20036下扩增出的部分图谱。

2.4 杂交种田间纯度鉴定

辣椒盛花期时对定植的杂交种H12进行田间纯度鉴定，对种植的每个单株进行植株、叶、花、果等性状的逐一辨别和分析，记录数据并统计结果。结果表明，田间种植的150株H12中，4株定植后死亡，剩余146株中有138株是杂交种H12，田间鉴定的纯度是94.5%。

3 讨论

3.1 SSR分子标记和田间表型性状2种纯度鉴定结果的一致性

本研究选出的引物Cams885能区分H12母本辣椒、H12父本辣椒和杂交种H12辣椒，这与张曼[3]的结果一致。选出的引物GP20036能够区分H12母本辣椒、H12父本辣椒和杂交种H12辣椒国内还没有人用于辣椒纯度鉴定，这是国内首次利用该引物区分辣椒父母亲本和其杂交种子。

图3 引物Cams885检测H12扩增部分的图谱

利用引物Cams885和GP20036对杂交种H12的种子进行纯度鉴定，结果发现，96个H12植株中引物Cams885扩增出92个植株条带清晰一致，引物GP20036扩增出86个植株条带清晰一致，纯度分别是95.8%和89.6%。利用田间表型性状检测杂交种H12种子的纯度，146株中有138株是杂交种H12，纯度为94.5%。利用SSR分子标记检测和田间表型性状观察杂交种H12种子的纯度结果相近，说明实验室利用SSR分子标记技术检测杂交种子和利用田间性状观察杭椒杂交种子纯度结果一致，实验室SSR分子标记技术检测杭椒杂交种子可以大大缩短纯度鉴定的周期，节约时间和精力。

3.2 影响杭椒杂交品种种子纯度的主要因素及解决方法

利用SSR分子标记技术检测发现存在个别植株条带缺失或条带不一样的情况，田间表型性状观察发现存在不一样的表型性状的植株，主要是非本杂交品种种子所致，存在杂株的主要原因是其他辣椒种子不经意的混杂，或者是母本没有授粉结果所致，亦或是隔离不严密存在个别植株或果实被非父本杂交所致。解决这些问题的方法是严格隔离，不让其他花粉混杂进来；仔细授粉，不漏下不授粉的母本；采收和烘晒种子尽量不让别的种子混杂进来。