菌群在过敏性疾病中的作用及干预

李 巍

在全球范围内过敏性疾病发病率不断增高的背景下，近20年来我国过敏性疾病的发病率也迅速增加[1]。因为宿主基因在短时间内难以发生大的变化,一般认为环境因素是导致过敏性疾病增多的主要原因[2]。人们很早就注意到环境因素在过敏性疾病中的作用，20世纪80年代发现农村人群过敏性疾病的发生率低于城市、兄弟姐妹多的孩子过敏性疾病发生率低于兄弟姐妹少的孩子，从而提出了著名的“卫生假说(hygene hypothesis)”，推测环境微生物在过敏性疾病中发挥重要的免疫调节作用[3]。近年来，一系列流行病学研究进一步发现幼儿时期避免抗生素、母乳喂养、经阴道生产、儿童时期接触宠物、母亲怀孕期间避免抗生素、母亲怀孕期间接触动物等都可以减少过敏性疾病的发生[2]。另外动物实验研究发现，无菌小鼠自发产生较高水平IgE[4]；在缺乏微生物的环境下，小鼠免疫系统倾向于产生Th2应答，而微生物的引入则使免疫应答向Th1和Th17方向偏移[5]。目前关于菌群的研究非常活跃，揭示了其在过敏性疾病中的重要作用和机制；也有众多应用益生菌治疗和预防过敏性疾病的研究报道，本文就菌群在过敏性疾病中的作用及干预做一回顾和讨论。

1 菌群是当前生命科学研究的热点

人体生活的环境中存在着大量的微生物，人体内部如肠道和身体表面也存在着大量的微生物，某一生态环境内的微生物的总和被称为菌群(microbiota)；微生物组(microbiome)是指某一生态环境下的所有微生物、编码微生物的基因以及微生物与宿主和环境的相互作用[2]。长期以来人们主要关注导致感染性疾病的致病菌，对肠道和其他身体部位常驻菌在生理和疾病状态下的作用直到最近10余年才被广泛关注。菌群研究的进步在很大程度上得益于二代测序技术的应用，目前主要有两种技术用于菌群的研究：16s rRNA测序和宏基因组测序(metagenomics)[2]。16s rRNA基因是细菌基因组上编码rRNA相对应的DNA序列，具有高度的保守性和特异性，通过特定的引物扩增以及高通量测序，可以分析某一样本中全部细菌的种类、数量(丰度)等。宏基因组测序一般采用鸟枪测序法(shotgun sequencing)，将基因组打碎成小的片段，连接barcode后高通量测序，通过生物信息学分析得到微生物整个基因组的序列。宏基因组测序不仅能够获得菌属种类的信息，更重要的是可以反映微生物的代谢等方面的功能，而且可以同时扩增病毒和真菌的序列。基于测序技术的菌群分析克服了以往细菌培养技术的低通量、低敏感性等不足，极大地推动了菌群研究的进展，具有划时代的意义。

目前关于菌群研究最活跃的领域是肠道菌群，90%以上的菌群文献是关于肠道菌群。最初的研究主要关注肠道疾病，如炎症性肠病、便秘等，发现这些疾病的肠道菌群均发生显著改变，给患者移植正常人的粪便或肠道菌群可以有效改善腹泻或便秘的症状[6]；之后研究发现肠道菌群也参与了糖尿病和肥胖等代谢性疾病，自身免疫和过敏等免疫相关性疾病，痴呆、自闭症等神经精神相关疾病的发生；在肿瘤领域，肠道菌群不仅参与了多种消化道肿瘤如结肠癌、胰腺癌的发生，也参与了肠道外肿瘤的发病，在肿瘤治疗方面如PD-1抗体的治疗，其作用的发挥依赖合适的肠道菌群的存在[6]。除肠道菌群外，皮肤菌群、口腔菌群也参与了多种区域和(或)系统疾病，如皮肤菌群参与了特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)、痤疮、银屑病、白癜风等皮肤疾病的发病，也参与了食物过敏等系统疾病[7]；口腔菌群参与了牙周炎、龋齿等口腔疾病，也参与了类风湿关节炎、糖尿病、冠心病、消化道肿瘤等系统疾病[8]。另外呼吸道菌群及生殖道菌群也具有重要的生物学功能。与过敏性疾病相关的菌群主要是肠道菌群和皮肤菌群，鼻腔菌群与过敏性鼻炎也具有相关性。

2 过敏性疾病菌群的变化和作用

过敏性疾病的一个显著特点是过敏性进程(allergy march)，即在婴幼儿时期最早出现AD，之后出现食物过敏，再发生过敏性鼻炎和过敏性哮喘，Th2应答和屏障功能障碍是这一系列过敏性疾病的共同特征，菌群参与了过敏性进程的各个阶段[9]。人们最早关注的是AD患者的肠道菌群，早期基于16s rRNA扩增和测序的研究发现儿童AD患者粪便中细菌的多样性下降，在菌属/种水平的分析发现乳酸杆菌、双歧杆菌以及梭酸芽孢杆菌与AD发生具有相关性[10-11]。后续有研究采用16s rRNA测序结合宏基因组测序的方法分析了AD患者肠道菌群，发现在多样性上没有差异，普氏粪杆菌的含量升高，膳食纤维代谢产物丁酸和丙酸在粪便中的含量降低[12]。AD患者菌群研究更多的集中在皮肤菌群，研究发现AD患者皮损和非皮损皮肤的菌群多样性显著低于正常人，金黄色葡萄球菌的丰度显著增高，多种常驻菌如乳酸杆菌、丙酸杆菌的丰度下降[13]； AD患者皮肤菌群的改变与患者年龄密切相关，在皮损出现之前，皮肤菌群即发生变化，提示皮炎可能不是菌群发生改变的原因[14]； AD患者皮肤的宏基因组的分析，在多样性和菌种水平得到了与16s rRNA测序相类似的结果，在菌群功能方面，发现多种代谢通路发生变化，比较显著的包括色氨酸代谢通路的改变[15]。

食物过敏患者的肠道菌群也发生显著改变，而且特定菌属/种跟食物过敏症状的消失相关。Bunyavanich等[16]发现梭状芽孢杆菌和拟杆菌与牛奶过敏症状消失相关，提示这两种细菌可以作为益生菌治疗食物过敏；基于宏基因组的研究显示，短链脂肪酸代谢水平在食物过敏患者中下降。食物过敏患者的皮肤菌群也发生异常，金黄色葡萄球菌的定植与持续的过敏症状相关，提示经皮致敏以及皮肤炎症在食物过敏中可能发挥作用[17]。对哮喘患者肠道菌群的研究发现，哮喘高风险的患儿在3个月大时肠道菌群紊乱，毛螺菌属、韦荣球菌属、粪杆菌属和罗思菌属的丰度低于正常对照，粪便中菌群代谢产物乙酸含量降低，向小鼠模型补充上述4种菌属，可以缓解呼吸道的炎症[18]。另外一项研究发现婴幼儿时期的粪便菌群从组成上分为3种模式，与2～4岁发生的过敏症状如哮喘具有不同的相关风险，其中高风险模式中双歧杆菌属、AKK菌属和粪杆菌属的丰度显著降低[19]。

综上，肠道菌群与过敏性疾病的发生相关，在婴幼儿和儿童时期这一相关性最为显著和确凿，随着年龄的增加，这种相关性逐渐消失。这一现象提示，生命早期菌群对免疫系统发挥着非常显著的影响，有可能确立机体的Th2“免疫背景”，之后在相应环境因素的作用下，皮肤屏障或呼吸道屏障的区域免疫应答向Th2偏移，最终发生过敏性疾病。

3 益生菌在过敏性疾病预防和治疗中的应用

人们很早就尝试改变肠道菌群以调节机体的免疫状态，如食用酸奶等富含乳酸菌的食品改善便秘等消化道症状。近年来菌群的研究为利用肠道菌群治疗疾病提供了新的依据，也使得治疗更具有针对性。益生菌(probiotics)指一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道等部位、能产生确切的健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称；益生元(prebiotics)是一种可通过选择性地刺激一种或数种菌落中的细菌的生长与活性而对宿主产生有益影响的物质[2]。

益生菌的选择一般是基于对患者肠道菌群的数据分析，或者根据对不同功能的菌种进行筛选的实验室研究，之后在动物层面证实益生菌的治疗和预防效果，最后开展临床试验进行验证[20]。有研究组将不同的细菌刺激体外培养的小鼠肠道树突状细胞，筛选可以促进树突状细胞产生IL-10的菌种，之后将筛选到的细菌口服应用于小鼠，分析这些细菌对多种炎症性疾病模型的作用，发现两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊乳杆菌、嗜热链球菌的组合可以有效诱导Treg产生，抑制AD等小鼠炎症模型[20]。其他的一些动物实验也研究了不同菌种在预防和治疗AD、过敏性哮喘等模型中的作用，均显示了一致的良好治疗和预防效果[20]。益生菌在过敏性疾病中的治疗/预防作用主要有四方面的机制：(1)调节Th1/Th2的平衡；(2)诱导Treg的产生；(3)促进抗原特异性IgG/IgA产生，抑制抗原特异性IgE产生；(4)拮抗致病菌，维持黏膜屏障，促进抗微生物肽的产生等[20]。

基于临床和实验室的数据，人们开展了一系列临床试验来研究益生菌在治疗和预防过敏性疾病中的作用，目前的研究主要集中在AD，应用的细菌主要是双歧杆菌和乳酸杆菌。在AD治疗方面，来自多项临床试验的结果不尽相同，一篇纳入了25项临床试验、1 599名病例的荟萃分析文章显示，益生菌治疗对于1～18岁AD患者有效，小于1岁AD患者无效；不同细菌混合或不同乳酸菌种混合的效果优于单独双歧杆菌[21]。另一篇纳入了13项临床试验的荟萃分析文章显示益生菌在汇总分析层面没有显示出与对照组的差异，但在进一步的分层分析中发现：益生菌治疗对于亚洲AD患者有效，欧洲患者无效；重度AD有效；1～18岁AD有效；鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌无效，发酵乳杆菌、唾液乳杆菌以及混合菌种对儿童AD治疗有效[22]。而在预防方面，荟萃分析显示，益生菌的使用对于AD的预防具有一定效果[23]。对食物过敏的益生菌治疗，研究发现鼠李糖乳杆菌与深度水解奶粉同时使用，可以有效减少牛奶过敏儿童的伴发过敏症状，促进对牛奶的耐受；一项RCT研究显示，鼠李糖乳杆菌与口服免疫耐受同时使用可以增加口服免疫耐受的效果[20]。在过敏性鼻炎和哮喘方面的益生菌治疗研究较少，目前没有确定的结论。

造成不同研究之间结果差异的原因在于：(1)样本量偏小；(2)受试者所属地域、种族的不同；(3)研究所采用的菌种的差异；(4)纳入患者的年龄不同[20]。目前各国际主流学会尚未推荐将益生菌用于过敏性疾病的预防和治疗。WAO基于29个临床试验的一项荟萃报告认为，目前尚没有足够的证据支持推荐将益生菌用于过敏性疾病的预防；但是对于有过敏性家族史的孕妇和哺乳妇女，使用益生菌可能是有帮助的；因为证据不足，目前尚没有推荐具体的菌种/菌株及剂量用于预防或治疗[24]。使用益生菌可能的风险包括系统感染、影响宿主代谢功能、易感个体的过度免疫应答、基因转移等等；另外在技术上也存在一些问题，如标准化、细菌的定量等等。因此，目前还需要继续深入研究菌群在过敏性疾病中的作用和机制，以选择更加有效的菌株开展治疗和预防研究，也需要采用标准化并统一定量的菌株进行大样本、多中心的临床研究以进一步阐明益生菌的治疗/预防作用。

4 展望

目前的研究已经初步揭示了菌群在过敏性疾病中发挥重要的作用，但具体机制尚未完全阐明。在应用方面，菌群的代谢产物更能够体现菌群的功能，以往研究已经揭示了菌群代谢产物在调节机体免疫应答中的作用[25]，代谢产物作为小分子化合物可以克服活菌(益生菌)的诸多不足，有可能成为未来治疗的主要方向。