秋刀鱼中组胺菌的分离及其理化性质研究

江 凯，王韦华，陈 伟，王利斌，汤海清，罗海波，郁志芳

（1.浙江医药高等专科学校 食品学院，浙江 宁波 315100；2.南京农业大学 食品科技学院，江苏 南京 210095；3.浙江万里学院 生物与环境学院 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验，浙江 宁波315100；4.南京师范大学食品与制药工程学院，江苏 南京 210043）

秋刀鱼（Cololabis saira），俗称竹刀鱼，广泛分布于西北太平洋公海及其沿岸海域，是一种重要的远洋经济鱼类[1]。秋刀鱼含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、矿物质和维生素等，味道鲜美，营养丰富，而且具有一定的抑制高血压、心肌梗塞和动脉硬化等作用，深受广大消费者喜爱[2]。然而，秋刀鱼从捕捞到直接销售或加工至少需要2个月，在贮藏销售过程中经常会因微生物的活动产生大量生物胺尤其是组胺，而人体摄入8～40 mg组胺即可引起轻微中毒，严重的可致休克甚至死亡[3-4]。研究表明，青皮红肉鱼类（如鲭鱼、鲐鱼、金枪鱼、秋刀鱼、沙丁鱼、鲣鱼等）中组胺产生与组胺菌生长代谢直接相关，水产品在没有受到组胺菌污染的情况下即使腐败也不会产生组胺，抑制组胺菌的生长代谢有利于降低青皮红肉鱼类的组胺含量，因此对水产品中组胺菌的分离鉴定及其理化性质的研究成为科研人员的重要课题。目前，研究人员已从鲣鱼[5-6]、金枪鱼[7]、鲅鱼[8]、鲭鱼[9]和发酵鱼[10]等水产品中分离出了几十种组胺菌，但不同的产品及不同的贮藏条件其优势组胺菌有较大差异。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 秋刀鱼原料购自宁波南联冷冻食品有限公司，取7条冻藏（-18℃）保存的秋刀鱼用无菌袋装好，于4℃放置5 d备用。

1.1.2 试剂 磷酸组胺、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、正戊醇、对硝基苯胺、亚硝酸钠、盐酸二甲基对苯二胺、α-萘酚、无水乙醇、高氯酸、氢氧化钠、盐酸、硼酸、酚酞、甲基红、次甲基蓝等均为分析纯；蛋白胨、酵母浸膏、琼脂、平板计数琼脂（PCA）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），杭州百思生物技术有限公司；结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）、硫代硫酸钠柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）、假单胞菌琼脂基础（CN基础），杭州微生物试剂有限公司；假单胞菌CFC选择培养基、大肠杆菌生化鉴定管（HBIG13）、肠杆菌科细菌生化鉴定条（HBIG08）及相关试剂盒，青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 仪器 THZ-98A恒温调速多用振荡器，金坛市维诚实验器材厂；G6全自动菌落计数器，SHINESO迅数；SW-CJ-1F洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；智能恒温恒湿箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅，上海维诚仪器有限公司；BSA224S-CW电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV2200型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；自动旋涡混合器，天津药典标准仪器厂；DHG-9247A电热恒温干燥箱，上海贺德实验设备有限公司；SCIENTZ-09无菌均质器，宁波新芝生物科技股份有限公司；MLS-3780高压蒸汽灭菌器，三洋电机株式会社；AllegraTM64R台式高速冷冻离心机，德国贝克曼公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 组胺选择性培养基：酵母膏5 g、胰蛋白胨 5 g、L-组氨酸 20 g、氯化钠 5 g、琼脂 15 g、甲酚红（0.5 g/100 mL）20 mL，蒸馏水定容至1 000mL，调pH值至6.5。组氨酸肉汤液体培养基：酵母膏3 g、蛋白胨10 g、L-组氨酸5 g、葡萄糖10 g，50%海水定容至1 000 mL，调pH值至6.5。半海水培养基：酵母膏 2.5 g、牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖1 g、琼脂20 g，50%海水定容至 1 000 mL，调pH值至7.0。半海水流动培养基将琼脂改为3 g，其余不变。以上培养基121℃蒸汽灭菌15～20 min，冷却备用[3，9]。

1.2.2 菌株分离纯化 无菌操作下称取25 g秋刀鱼中段（含内脏）样品绞碎后放入无菌袋，加入225mL 0.9%无菌生理盐水，于均质器中拍打3 min，按照 10 倍稀释法稀释为 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6备用。分别吸取不同稀释度菌液0.1 mL于平板计数琼脂（PCA）培养基、半海水培养基、假单胞菌CFC选择性培养基、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）培养基、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂培养基和假单胞菌琼脂（CN）基础培养基，置36±1℃培养48～72 h。根据菌落边缘、颜色、大小、凹凸等特性，挑取不同菌落接种于胰胨大豆琼脂（TSA）斜面，36±1℃培养48 h。将TSA斜面菌种接种于组胺选择性培养基，36±1℃培养48 h，周围显红色的菌落为组胺菌。

1.2.3 组胺定性检测 参照陶志华等[3]的方法稍作修改。将单菌落接种于组氨酸肉汤液体培养基，36±1℃培养24～48 h，取1 mL培养液加入5 mL 80%乙醇，12 000 r/min离心10 min，将上清液转移到新的试管中，加入0.5～1 mL 0.5%甲酚红溶液，振荡后与空白对照（黄褐色）进行比较，阳性组呈橙红色。

1.2.4 组胺定量检测 参照GB/T 5009.45—2003水产品卫生标准的分析方法测定样品中组胺含量[10]。

1.2.5 理化性质分析 1）革兰氏染色：参照文献[11]所述革兰氏染色法操作。

2）运动性检测：用接种针取少量菌种接种于半流动海水培养基实验管内，36±1℃培养48 h后观察。实验管内培养基全部呈浑浊状态为具有运动性，只在接种处生长的菌种为非运动性[12-13]。

3）HBIG13和HBIG08实验：挑取单菌落于无菌生理盐水中振荡均匀，每孔加入100 μL菌悬液，其中固体和半固体生化管采用穿刺接种，按照鉴定管/条说明书进行操作。赖氨酸、鸟氨酸和氨基酸对照用灭菌的石蜡覆盖液面。接种后盖上盖子，36±1℃培养48 h，根据颜色变化判定阳性和阴性[12-13]。

4）氧化酶实验：取白色洁净滤纸沾取菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚溶液一滴，阳性30 s内呈现鲜蓝色，阴性2 min内不变色[12-13]。

5）过氧化氢酶实验：用接种环取培养48 h的斜面菌种一小环涂抹于无菌载玻片上，滴1滴3%H2O2溶液，如有气泡产生则为阳性，无气泡产生则为阴性[12-13]。

6）糖分解实验：在组氨酸肉汤培养液实验管内放入发酵管，121℃蒸汽灭菌20 min，冷却至40℃左右，用接种针取少量菌种接种于实验管内，36±1℃培养48 h后观察。发酵管内有气体为阳性，否则为阴性[12-13]。

1.2.6 不同温度对分离菌株组胺产生能力的影响吸取分离纯化后的菌株培养液20 μL接种到5 mL组胺酸肉汤培养液中（pH 值 6.5），分别于 4±1、20±1、25±1、30±1 和 36±1 ℃静置培养 24 h， 吸取 0.5mL均一的组胺酸肉汤培养液，加入1.5 mL 80%乙醇，8 000～10 000 r/min离心10 min，上清液按照GB/T 5009.45所述方法测定组胺浓度。

1.2.7 不同pH值对分离菌株组胺产生能力的影响吸取分离纯化后的菌株培养液20 μL分别接种到5mL 不同 pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的组胺酸肉汤培养液中，于36±1℃静置培养72 h，每24 h取样测定组胺浓度。

1.3 数据处理

实验每个处理均重复3次，分别求其平均值和标准差，并用统计软件SPSS19.0进行显著性（LSD；p＜0.05）分析，用 Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 微生物分离

预实验研究结果表明，新鲜秋刀鱼菌落总数在（1.6～2.2）×102cfu/g之间，组胺菌数量较少，采用100、10-1、10-2稀释度菌悬液均未分离获得组胺菌，而秋刀鱼在0～4℃低温下贮藏期间菌落总数迅速上升，贮藏5 d已超过1.0×106cfu/g。因此，为获得较好的分离效果，实验将秋刀鱼于4℃放置5 d后进行组胺菌分离。秋刀鱼菌悬液通过PCA培养基、半海水培养基、CFC选择性培养基、VRBGA培养基和TCBS琼脂培养基初筛，获得菌落特征不同的菌株10株，挑取单菌落接种到TSA斜面纯化后，将其接种到组胺选择性培养基，发现有5株菌呈组胺阳性反应，分别编号为菌株1～5并进行理化特性分析。

2.2 菌株理化特性

表1显示，菌株1～5均为革兰氏阴性菌，菌株1、2 为非运动性，菌株 3、4、5 具有运动性，5 株菌均不产硫化氢，不能利用肌醇、山梨醇和核糖醇。根据表1理化特性分析结果参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《伯杰细菌鉴定手册》[13]，初步确定 5株菌分别为哈夫尼菌属（Hafnia）、志贺氏菌属（Shigella）、变形菌属（Proteus Hauser）、沙雷铁氏菌属（Serratia）和假单胞菌属（Pseudomonas）。

表1 菌株鉴定结果Table 1 Identification results of 5 isolated strains

2.3 不同培养温度对分离菌株组胺产生能力的影响

图1显示，分离出的5株菌均有较强的组胺产生能力，培养24 h组胺质量浓度在6.27～26.77 mg/mL之间。温度对菌株1～5组胺产生能力均有显著（p＜0.05）影响，20、25和36℃温度下各菌株组胺产生能力较高，其最适温度分别为20、36、36、20和25℃，培养 24 h后组胺质量浓度分别为 24.87、23.12、21.47、26.77和24.52 mg/mL，表明此5株菌均为嗜温菌且组胺产生能力较强。图1还显示，尽管4℃低温下各菌株组胺产生能力受到显著 （p＜0.05）抑制，但经24 h培养后组胺质量浓度仍达到较高水平（7.62～13.67 mg/mL），这可能与秋刀鱼在4℃低温贮藏条件下组胺含量仍快速上升有关。需要特别指出的是，30℃温度下各菌株组胺产生能力均显著（p＜0.05）降低，其中菌株1和菌株4组胺质量浓度甚至低于4℃，表明30℃不适合此5株菌产生组胺。

图1 不同培养温度对分离菌株组胺产生能力的影响Fig.1 Effects of different incubation temperatures on the histamine producing capacity of 5 isolated bacteria

2.4 不同pH值和培养时间对分离菌株组胺产生能力的影响

图2显示，菌株1～5在pH值4.5～8.5范围内均能代谢产生组胺，pH值和培养时间对菌株1～5组胺产生能力有显著（p<0.05）影响，各菌株分别在pH值为 8.5、7.5、6.5、6.5 和 7.5 的条件下培养 72 h 后表现出最大组胺质量浓度，pH值4.5～5.5对各菌株组胺产生能力有显著（p<0.05）抑制作用，表明该5株菌适宜在pH值6.5～8.5条件下生长产生组胺。需要特别指出的是，尽管菌株1～5在大多数pH值条件下，组胺产生量随培养时间的延长逐渐增加，但在少数pH值下有下降现象，如菌株1在pH值4.5和5.5、菌株2和菌株3在pH值6.5、菌株4在pH值4.5、菌株5在pH值4.5和7.5，是取样误差还是实验错误，具体原因值得进一步研究。

图2 不同pH值和培养时间对分离菌株组胺产生能力的影响Fig.2 Effects of different pH value and incubation time on the histamine producing capacity of 5 isolated bacteria

3 讨论

研究发现一些细菌体内具有较强活性的脱羧酶，可催化青皮红肉鱼类中的组氨酸脱羧而产生组胺，当鱼鲜度下降甚至腐败后就会产生大量组胺，食用过量的组胺便有中毒的危险，因此大量的研究也主要集中在组胺菌分离鉴定及其理化特性等方面[14]。表2总结了近年来科研人员在不同水产品中分离鉴定出的组胺菌，其中肠杆菌属（Enterobacteriaspp.）、 假单胞菌属 （Pseudomonasspp.）、 摩根菌属（Morganellaspp.）、柠檬酸杆菌属（Citrobacterspp.）、肺炎杆菌属 （Kielbasasspp.）、 芽孢杆菌属（Bacillus）、 弧菌属 （Vibriospp.） 和葡萄球菌属（Staphylococcus）是水产品中发现较多的组胺菌属，在适宜环境条件下这些菌的组胺产生能力大多能达到1 mg/mL以上，表明这些菌是导致青皮红肉鱼类组胺中毒的主要细菌，在贮藏及生产加工过程中应进行重点控制。此外，变形杆菌（Proteus vulgaris）、雷氏普罗威斯登菌（Providencia rettgeri）、嗜盐链球菌（Tereagenococcus halophilus）和解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica）在少数水产品中也有发现，且具有较强的组胺产生能力。本实验从不新鲜的秋刀鱼中不仅分离到假单胞菌属（Pseudomonas）和变形菌属（Proteus Hauser），而且还分离获得3株新的组胺菌，分别为哈夫尼菌属（Hafnia）、志贺氏菌属 （Shigella）和沙雷铁氏菌属（Serratia），在适宜培养条件下5株菌的组胺产生能力均高达20 mg/mL以上，这可能是秋刀鱼容易腐败变质的重要原因。

温度和pH值是影响组胺菌产生组胺的重要因素，不同组胺菌适宜的温度不同，同时受环境中氢离子浓度的影响。从表2可知，大部分组胺菌的适宜温度和pH值分别在20～36℃和6.5～7.5范围之间，属于中温菌，且适宜在中性偏碱性环境中生长产生组胺。研究表明，低温和pH值5.5以下酸性环境能抑制水产品中组胺菌的活动从而减少组胺的产生。童玲等[6]研究发现，在0和4℃环境下，扁舵鲣中肠杆菌科 （Enterobacteriaceae）、假单胞菌属（Pseudomonasspp.）和弧菌属（Vibriospp.）等组胺菌生长繁殖受到抑制，其中弧菌属在5 d贮藏期间几乎停止生长。本实验研究获得的5株菌适宜温度分别为 20、36、36、20和 25℃，适宜 pH 值分别为 8.5、7.5、6.5、6.5和7.5，与前人研究结果基本一致。然而，尽管4℃低温显著（p<0.05）抑制了5株菌组胺产生能力，但经24 h培养后仍能产生较高质量浓度的组胺，这与弧菌属（Vibriospp.）在低温下的反应不同。

根据目前已分离鉴定组胺菌的理化特性分析结果，不同组胺菌适宜的生长温度、pH值及组胺产生能力大小均不相同，即使不同产品中分离得到的相同菌株其组胺产生能力也存在较大差异，尤其在冻藏（<-18℃）温度下和腌渍过程中这些组胺菌的特性还知之甚少。在今后的研究中，通过分析不同组胺菌在-18℃或更低冻藏温度条件下或低温腌渍等过程中的生长及其理化特性，发现优势组胺菌群并提出针对性的控制措施，对维持青皮红肉鱼类鲜度确保食用安全具有重要的意义。

表2 不同菌株组胺产生能力Table 2 Bistamine producing capacity of different bacteria

4 结语

本研究分离获得5株菌能产生组胺并初步鉴定为哈夫尼菌属（Hafnia）、志贺氏菌属（Shigella）、变形菌属（Proteus Hauser）、沙雷铁氏菌属（Serratia）和假单胞菌属（Pseudomonas）。5株菌在适宜的培养条件下均有较强的组胺产生能力，适宜培养温度范围为20～36℃，4℃下仍能产生大量组胺；在pH值4.5～8.5范围内均能生长，适宜pH值范围为6.5～8.5。以上结果为秋刀鱼组胺菌控制提供了理论依据。