营养元素引发对低温下棉苗保护性酶活性及叶绿素荧光参数的影响

夏军 王远远 乔露 陈宗奎 马卉 高宏云 罗宏海

摘要：在人工模拟气候条件下，以MnSO4·H2O、KCl、CuSO4·H2O为相应Mn源、K源、Cu源，對棉种进行营养元素引发试验，研究不同营养元素引发对低温（8 ℃）胁迫下棉种发芽率、棉苗保护性酶活性及叶绿素荧光参数的影响。结果表明，在低温胁迫下，与CK处理相比，经过营养元素引发，棉种种子活力增强，发芽率提高，棉花幼苗期的过氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量降低，可溶性蛋白含量提高;低温胁迫24 h后，营养元素引发处理组棉花幼苗叶片的光系统Ⅱ（PSⅡ）最大光化学效率（Fv/Fm）、非光化学猝灭系数（NPQ）、表观电子传递速率（ETR）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）平均值分别比CK处理高16.67%、17.55%、42.23%、6.09%，以Mn、K、Cu浓度分别为3.500、0.746、0280 g/L 时，棉种引发24 h的效果最佳。因此，中微量营养元素引发可增强低温胁迫下棉种活力，提高发芽率，同时增强棉苗的保护性酶活性，降低膜系统过氧化程度，提高叶片光合性能，进而增强棉花的抗低温能力。

关键词：棉花;种子引发;低温胁迫;发芽率;保护性酶;叶绿素荧光;棉花幼苗;抗冷性生理机制;冷害防御措施

中图分类号：S562.01   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0089-04

收稿日期：2018-05-10

基金项目：国家自然科学基金（编号：31460325）;国家大学生创新创业训练计划（编号：201510759050）。

作者简介：夏 军（1995—），男，陕西汉中人，硕士研究生，主要从事棉花抗逆生理研究。

通信作者：罗宏海，博士，教授，主要从事作物高产生理与节水栽培技术研究。

棉花（Gossypium hirsutum L.）为锦葵科棉属植物，起源于热带和亚热带区域，是典型的喜温作物，适宜的生长发育温度为20～30 ℃，对冷害胁迫反应敏感。新疆在我国棉产区中占据主要地位，具有典型的大陆性干旱气候，在棉花播种和幼苗时期，常出现倒春寒等低温气象，致使地表温度远低于棉花幼苗生长温度的最低点，甚至降低到0 ℃以下，使棉花出现烂种、烂芽甚至死苗等现象，最终造成棉花大幅度减产[1]。因此，提高棉苗抗低温能力、避免苗期冷害对于稳定新疆棉花生产具有重要意义。

低温胁迫会破坏植物体内活性氧平衡、抑制光合作用、大量积累渗透调节物质及降低抗氧化酶活性等[2]，使得细胞代谢错乱，甚至严重时导致植物死亡。因此，低温造成的冷害严重影响棉花生产[3]。姜春明等认为，低温条件下植物需要通过提高保护性酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等的活性以及可溶性蛋白质含量来清除有害物质，从而有效减小因低温造成的胁迫伤害[4]。植物在遭遇低温胁迫时，光合速率与冷害胁迫的持续天数及恢复时长有关[5]。杨美森等研究表明，在冷害胁迫下，外源NO处理可提高棉花幼苗叶片最小荧光产量（F0）、最大光化学效率（Fv/Fm）、表观电子传递速率（ETR）和实际光化学效率（ΦPSⅡ），增大非光化学猝灭系数（NPQ），使光合机构保持不变，维持光系统Ⅱ（PSⅡ）光化学活性的稳定，减缓冷害对幼苗生长的抑制作用[6]。低温常常导致棉花苗期生长发育受挫、光合速率下降等，进而影响棉花的产量和品质。

营养元素在作物生长发育过程中是不可或缺的无机元素，对种子萌发有着不同程度的调节作用[7]。营养元素浸种既可提高棉种种胚内细胞膜的修复及完善功能，又能增强细胞内细胞器、蛋白质及核酸的活性，是种子打破休眠、促进萌发的重要方法[8]。Miedema研究了低温胁迫对玉米幼苗生长发育的影响，结果表明，低温限制玉米种子在萌发阶段获取营养元素[9]。适当浓度的营养元素处理可以增强植物幼苗抗氧化系统的相关酶活性[10]。汪邓民等采用含有一定浓度K+、Ca2+、Zn2+的营养液对烤烟种子进行浸种，提高了种子的活力指数，并增强了烟苗的抗旱能力[11]。Ros等研究认为，播前给种子覆盖1层营养元素涂层是促进其早期生长的有效方法[12]。洪法水等研究表明，钙、锌单独或两者混合对玉米种子进行处理，可提高玉米种子在萌发过程中淀粉酶、脂肪酶、谷丙转氨酶活性，且可使种子活力增强，并可促进幼苗生长发育[13]。刘建凤等通过研究锰对玉米种子萌发的影响发现，锰处理提高了玉米种子的萌发特性，使种子的发芽势、发芽率和幼苗的呼吸速率以及根系活力均有所提高[14]。侯典云等研究表明，一定浓度的锰处理可促进小麦种子萌发及幼苗生长[15]。因此，通过营养元素引发可增强作物种子及幼苗的抗逆能力。棉花属于对冷害胁迫敏感的经济作物，目前关于营养元素引发对冷害胁迫下棉花种子发芽、幼苗生理生化、叶片叶绿素荧光参数特性影响的研究较少。为此，本试验从营养元素引发入手，研究营养元素引发处理对冷害胁迫下棉种发芽能力、棉花幼苗保护性酶活性及叶绿素荧光参数的影响，探讨营养元素引发提高棉花幼苗抗冷性的生理机制，为针对棉花苗期低温冷害制定有效的防御措施提供技术支撑及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

试验于2015年在石河子大学农学院作物栽培实验室人工气候箱中完成。供试棉花品种为新陆早52号，以MnSO4·H2O、KCl、CuSO4·H2O为相应Mn源、K源、Cu源，参照Imran等的种子引发试验方法[16]，并加以改进后进行试验。经前期预试验，筛选出发芽效果较好的营养元素组合及引发时间，分别为N1（3.500 g/L Mn+0.746 g/L K，引发时间24 h）、N2（3.500 g/L Mn+0.746 g/L K+0.280 g/L Cu，引发时间 12 h）、N3（3.500 g/L Mn+0.746 g/L K+0.280 g/L Cu，引发时间24 h）;以未引发、水（蒸馏水）引发为对照，分别为CK（未进行任何浸种）、W1（H2O 12 h）、W2（H2O 24 h）。具体操作为选取籽粒饱满、胚完整、无霉变、大小一致的棉花种子500粒，使用75%无水乙醇进行消毒，消毒后放入锥形瓶中进行引发12、24 h，然后分别浸泡于上述溶液中在8 ℃光照培养箱中进行不同时间（12、24 h）的低温吸胀处理，其后取出棉种，吸干表面水分，于55 ℃下干燥处理48 h，然后转入白天温度为18 ℃、夜间温度为8 ℃，光—暗周期为14 h—10 h的光照培养箱中进行发芽培养10 d，每个处理重复5次，每个重复100粒。

将经过回干处理的棉种播于装有基质的营养钵中在人工气候培养箱内进行幼苗培育，每钵播种4～5粒，以不引发、水引发棉种为对照。人工气候箱内温度维持在23～28 ℃范围内，光—黑周期为14 h—10 h，待子叶出土后每2～3 d浇1次水，保留生长均匀一致的幼苗，当植株长至2叶1心时对幼苗进行低温胁迫试验。将幼苗放在8 ℃的人工培养箱中进行低温处理，在胁迫24 h后取出，转入正常温度的光照培养箱内进行培养。在低温胁迫12、24 h时选取生长发育一致的植株，测定处理与对照完全展开的第2片真叶的叶绿素荧光参数，并测定低温解除后第2片真叶的保护性酶活性，重复3次。

1.2 测定方法

1.2.1 发芽率的测定

记录各处理在相同时间段内的发芽情况，以胚芽鞘长度大于1 mm记为发芽，培养7～10 d后，记录发芽种子数。发芽率计算公式为

发芽率=发芽数/种子总数×100%。

1.2.2 生理生化指标的测定

采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法测定棉种活力。称取0.5 g幼苗叶片放入研钵中，加入0.1 mol/L pH值为7.8的磷酸缓冲液冰浴研磨后导入离心管中，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min，取上清液冷藏备用。采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性，硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛（MDA）含量，考马斯亮蓝 G-250 染色法测定可溶性蛋白质含量[17]。

1.2.3 叶绿素荧光参数的测定

采用PAM-2100便携式调制荧光仪和2030-B光适应叶夹测定叶片的叶绿素荧光参数。将棉花幼苗遮光处理30 min后取下叶片，调整叶绿素荧光成像系统并设定工作参数，测定叶绿素荧光动力学曲线，获取F0、ΦPSⅡ、Fv/Fm、NPQ和ETR等叶绿素荧光参数。

1.3 数据处理

数据采用Microsoft Excel 2010进行统计，SPSS 18.0软件进行方差分析，Sigmaplot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 营养元素引发对低温胁迫下棉种发芽率的影响

由图1可知，与CK处理相比，在低温胁迫下棉种经过营养元素引发后，发芽率明显提高，而水引发以W2处理效果较好，与CK处理呈显著性差异。营养元素引发以N3处理效果最好，其发芽率为50%，与CK、W1、W2处理差异显著。在低温胁迫下，各处理的发芽率表现为N3处理>N1处理>W2处理>N2处理>CK处理>W1处理。

2.2 营养元素引发对低温胁迫下棉花种子活力的影响

由图2可知，在低温胁迫下，经营养元素引发的棉花种子活力与CK处理相比提高16%～34%;与水引发（W1、W2处理）相比，提高9%～27%，差异均显著。在营养元素引发处理中以N2处理的种子活力最高，为82%。

2.3 营养元素引发对低温胁迫下棉花幼苗MDA含量、POD活性及可溶性蛋白含量的影响

2.3.1 营养元素引发对低温胁迫下棉花幼苗MDA含量的影响

MDA含量在植物衰老和抗性生理研究中，体现细胞膜系统的膜脂过氧化和细胞分隔化程度[4]。由图3可知，冷害胁迫后，营养元素引发处理组的MDA含量显著低于对照组，其中N3处理的MDA含量最低，为1.741 nmol/g。表明营养元素引发能降低棉花幼苗叶片内的MDA含量，缓解低温胁迫导致的膜脂过氧化伤害，维持细胞的正常代谢。

2.3.2 营养元素引发对低温胁迫下棉花幼苗POD活性的影响

植物体中含有大量活性较高的过氧化物酶，与超氧化物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶构成植株体内主要的活性氧清除系统，其活性可作为组织老化的一种生理指标[18]。从图4可以看出，处理组的POD活性均显著低于对照组，其中N2处理最低，为0.266 U/（g·min）。说明在冷害胁迫下，营养元素引发组棉花幼苗体内的POD活性低于对照组，可见营养元素引发可缓解植株在低温胁迫下的老化速度。

2.3.3 营养元素引发对低温胁迫下棉花幼苗可溶性蛋白含量的影响

可溶性蛋白是细胞中重要的渗透调节物质及营养物质，其增加和积累均能提高细胞的保水能力，对细胞生命物质和生物膜具有一定的保护作用[19]。由图5可知，在低温胁迫下，营养元素引发处理中只有N2处理的可溶性蛋白含量低于W1、W2处理，高于CK处理，且与CK处理差异显著;N1、N3处理的可溶性蛋白含量较高，分别为0.471、0.460 mg/g，高于其他处理，进一步说明营养元素引发提高了幼苗体内的可溶性蛋白含量，保护了细胞结构的完整性。

2.4 营养元素引发对低温胁迫下棉花幼叶叶绿素荧光参数的影响

叶绿素荧光作为研究光合作用变化的探针，主要通过分析各种荧光参数来获知有关光能利用途径信息。从表1、表2可以看出，随着冷害胁迫时间的增加，叶片的荧光参数总体呈降低趋势，其中营养元素引发组与对照组的NPQ和ΦPSⅡ无明显差异;冷害胁迫12、24 h后，营养元素引发处理的F0值分别比CK处理低0.077～0.143、0.082～0.125;营养元素引发组的Fv/Fm、ETR、NPQ和ΦPSⅡ高于CK组7%～17%，且处理后的ETR显著提高。

3 讨论

温度为影响种子萌发的一个重要因素。适宜的生长温度能为种子提供良好的萌发环境[20];研究表明，棉花种子萌发的最适温度为28 ℃左右，25 ℃是种子萌发最适温度的下限，種子萌发的最低温度为10.5～12.0 ℃。随着温度的降低，棉种的发芽率、发芽指数、种子活力等均呈下降趋势[21]。营养元素作为作物生长发育过程中不可或缺的无机元素，在种子萌发过程中起着一定的调节作用[7]。侯典云等研究表明，一定浓度的Mn处理促进了小麦种子萌发及幼苗生长[15]。程昕昕等采用Mn2+、Zn2+、K+营养元素处理种子，结果发现，处理组种子的发芽势与对照差异显著[7]。本试验结果表明，在低温胁迫下，棉种经过营养元素引发后，与对照组相比，N1、N3处理发芽率与种子活力显著提高，其中以N3处理引发效果最好，发芽率为50%，与前人研究结果[22]相一致，表明营养元素引发对种子萌发过程具有一定的调节作用，可以提高种子的萌发特性。

种子在萌发过程中快速吸胀后，低温胁迫会破坏质膜结构，增大质膜的通透性，造成细胞内糖、氨基酸和核苷酸等物质外渗，导致细胞代谢紊乱[23]。活性氧（ROS）代谢平衡被打破后，出现大量具有高度氧化活性的ROS，细胞膜系统遭到嚴重破坏，引起不饱和脂肪酸过氧化生成MDA。为了降低自由基对细胞造成的伤害，可通过增加植物体内的渗透调节物质，降低细胞渗透势，提高植物自身适应逆境的能力，同时形成与植物细胞相对应的保护系统[24]。适量的营养元素处理可以增强植物幼苗抗氧化系统中的酶活性，降低MDA含量[7]。本试验表明，在低温胁迫下，经营养元素引发，棉苗的MDA含量、POD活性降低，可溶性蛋白含量增加，说明营养元素引发可加强细胞膜的自我保护能力，降低膜系统过氧化程度，加强细胞中ROS清除能力，进而使其抗低温能力得到提高。

对喜温植物而言，低温降低了生化代谢过程中的酶活性，提高了光系统发生光抑制的可能性，破坏了植物的光合机构[25]。植物在受到冷害胁迫时，光合速率与冷害胁迫的持续天数及恢复时长有关[5]。前人研究表明，棉花经低温胁迫处理后，线性电子传递和二氧化碳固定能力降低，积累PSⅡ反应中心过剩激发能[26]。肖飞等研究表明，棉花经低温处理后，叶片光合系统的Fv/Fm、qP、ETR及Y（Ⅱ）持续降低，棉花叶片光合作用强度降低，PSⅡ发生严重的光损伤[27]。本试验表明，随着低温胁迫时间的延长，棉花幼叶的荧光参数整体呈现降低趋势，营养元素引发组与对照组的NPQ和ΦPSⅡ间无明显差异;N2、N3处理的F0、Fv/Fm、ETR与CK处理达显著性差异水平，且ETR显著提高。表明经营养元素引发后，棉花幼苗在低温胁迫下的自我保护能力增强，通过提高热耗散消耗过多激发能来适应低温胁迫环境，具有更好的光化学性能。

4 结论

在低温胁迫条件下，棉种经过营养元素引发后，N1、N3处理发芽率、种子活力均得到提高，其中以N3处理效果最优;棉花幼苗在冷害胁迫下，营养元素引发组棉苗保护性酶活性与对照组有明显差异，MDA含量、POD活性显著降低，可溶性蛋白含量提高;低温胁迫12 h后，营养元素引发组幼苗叶片的F0、ETR、ΦPSⅡ与CK处理差异显著;低温胁迫24 h后，营养元素引发组棉花幼苗叶片的F0、NPQ均与CK处理呈显著性差异。说明营养元素引发通过增强棉苗的保护性酶活性、降低膜系统过氧化，改善低温胁迫下幼苗叶片的光化学性能，进而提高棉花幼苗的抗低温能力。

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