苹果园间种紫花苜蓿和香薄荷的根系分泌物对土壤肥力的影响

吴健健，张 杰，姚允聪

(北京农学院 植物科学技术学院/北京林果业生态环境功能提升协同创新中心，北京 102206)

果园行间种草在不侵占果树光照与养分的情况下，丰富了果园生态位[1]，减轻土壤冲刷和增强土壤保水抗旱能力，提高果实品质[2]。果园间种植物会产生“土壤残留物作用”[3]。植物—土壤反馈(Plant—Soil Feedback, PSF)这种物理、化学、生物学性状的变化又能影响宿主植物和其共存植物[4]。植物—土壤反馈作用可以引起土壤养分(有机碳、氮、磷、钾)的变化，以及土壤中元素(钙、镁、铁等)含量变化[5]。土壤酶在植物—土壤反馈系统中也扮演着重要角色，土壤酶活性化学计量特征常与植物和土壤化学计量特征密切相关[6]。

根系分泌物在植物与土壤之间发生正、负反馈调节作用，负反馈调节归因于土壤真菌病原体，它们在植物物种的存在下形成[7]。然而，对植物生长的负面影响也可能是由于化感作用[8]。化感作用是一种植物通过产生释放到环境中的化学化合物而对另一种植物产生的影响[8]。

果园间作特定草本植物具有不同的功能，间作豆科植物根系聚集根瘤菌，有较强的固氮能力[9]。间作一些芳香植物(如香薄荷、罗勒、藿香蓟、孔雀草等)会改善果园土壤理化性质，提高土壤有机质含量，改变细菌和真菌群落结构。已有研究发现，多年种植苜蓿根系会分泌酚酸类不易降解而累积在土壤中的自毒物质，出现生育状况变差、病虫害严重、产量降低、品质变劣的现象[10]。果树根系作为果树吸收土壤中水分和养分的主要器官,对于相邻的植物根系也会做出相应的可塑性反应[11]。这种果树根系和间种植物根系的交互作用对行间多年种植的间作植物—土壤反馈状况尚不了解。

本研究在果园多年间作植物的栽培历史条件下，以种植过香薄荷和紫花苜蓿的苹果园土壤为盆栽土壤种植苹果，模拟苹果园中间作植物的土壤环境，间种香薄荷和紫花苜蓿,以生草为对照，探究植物—土壤反馈条件下土壤肥力变化，从而确立果园长年种植芳香植物混合间作种类和模式，为我国果树有机化生产提供一定的理论依据和技术贡献。

1 材料和方法

1.1 试验材料及地点

植物材料：富士苹果幼苗(Malusdomestica‘Red Fuji’)；香薄荷(SaturelahortensisL.)；紫花苜蓿(Lablabpurpureus)。

土壤材料：取自北京市顺义区木林镇蒋各庄村有机观光苹果园，土壤为种植一年香薄荷和紫花苜蓿的行间土壤。

试验地点：北京农学院植科实践基地玻璃温室。

1.2 试验设计及方案

试验设计：试验设计3种因素水平，分别为取样时间，土壤类型，种植植物，时间因素有2个水平5月和8月，土壤类型有苜蓿土(M)、薄荷土(B)，种植植物香薄荷(b)、紫花苜蓿(m)、对照为生草(sc)。两两组合为6个处理：Bm，Bb，Bsc，Mm，Mb，Msc。每个处理设置6次重复构成1个小区，采用随机区组设计。

试验方案：植物—土壤反馈第一阶段：在苹果园，选取没有间种过植物的苹果行间，于2018年4月分别播种香薄荷、紫花苜蓿种子。2018年10月使用抖根法收集间种植物根际土壤，进行根系分泌物鉴定。

植物—土壤反馈第二阶段：于北京市北京农学院玻璃温室。2019-04-07栽种两年生苹果幼苗，苹果新根生长、枝条萌生后，2019-04-20播种香薄荷、紫花苜蓿种子，保证每盆中有20株间种植物。分别于苹果树两次根系旺盛生长期(2019-05-10)、(2019-08-10)取样。取土时每盆果树中取3个不同位点土壤，过孔径0.850 mm筛，将取得的样品4 ℃保存带回实验室，测定酶活性和土壤养分测试。

1.3 试验方法

土壤理化性质的测定参照土壤农化分析方法[12]。土壤含水量采用烘干法，土壤pH值电位测定法，有机质用重铬酸钾氯化法，全氮用半微量凯氏法，速效氮用碱解扩散法，全磷用高氯酸—硫酸酸溶—钼锑抗比色法，速效磷用碳酸氢钠法，全钾用火焰光度法，速效钾用火焰光度法，微量元素Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn的测定采用M3浸提—火焰分光光度法。脲酶活性用苯酚钠比色法，转化酶活性用3,5—二硝基水杨酸法，过氧化氢酶活性用KMnO4滴定法。

根系分泌物鉴定，制备根际土样，使用GC—MSD上机分析，色谱柱为Agilent DB5—MS (30 μm×0.25 μm×0.25 μm)。

1.4 统计分析

数据采用2007EXCEL作图，使用SPSS22进行统计分析，通过3因素方差分析了时间、土壤类型和植物种类及其相互作用的影响，Dunnett事后检验，以确定个体因素水平之间的显著差异。使用独立样本t检验方法对相同土壤条件下植物种类两两比较，确定植物类型对不同测试指标的显著差异。

2 结果与分析

2.1 苹果间种植物对土壤肥力的反馈

由图1可以看出，间种植物没有随时间的变化而改变土壤中有机质、全氮，但是对土壤的全磷、有效磷和全钾、有效钾的转化产生了极显著影响(P<0.001)，5月、8月对比，苜蓿土中种植苜蓿降低了土壤全磷23.30%，降低了全钾33.63%，而其他5个处理提高了土壤中全磷全钾含量，并且薄荷土壤中种植苜蓿提高了速效磷15.95%、速效钾125.44%，表现出对土壤肥力积极的正反馈效应。

左上角是因素间的显著性，显示了三个因素方差分析结果(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；ns，不显著)，时间因素 (Time, T)，有两个水平五月和八月，土壤类型 (Soil, S)有苜蓿土M、薄荷土B，植物物种 (Plant, P)有三个水平苜蓿m、薄荷b、生草sc。折线连接为8月植物物种基于T检验显著性；图2-3同Note: The upper left corner is the significance between the factors, showing the three factors analysis of variance (*,P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001; ns, not significant), time factor (Time , T), there are two levels in May and August, soil type (Soil, S) has bauxite M, mint B, plant species (Plant, P) has three levels bauxite m, mint b, grass sc. The fold line is connected to the August plant species based on the T test图1 间种植物对果园土壤肥力影响Fig.1 Effects of intercropping on soil fertility in orchard

在薄荷土中种植苜蓿相对于种植薄荷和生草处理极大的提高土壤全钾含量(P<0.001)，并且发现苜蓿土中种植苜蓿草的土壤全钾量反而比种植薄荷低24.7 mg/kg (P<0.05)，同时在全磷指标中也观察到了相似的现象，不过从全磷、全钾和速效磷3个指标中可以看出，间种生草处理在的数值要低于间种苜蓿和薄荷的处理。此外植物种类和种植时长对有机质、全钾、全磷、速效钾和速效磷有交互作用，也就是种植时长对土壤肥力在植物物种间存在差异。植物物种和土壤类型对磷、钾的转换也存在交互作用(P<0.001)。

2.2 苹果间种植物对土壤营养元素的反馈

由图2可以发现，时间与土壤类型都显著影响土壤中营养元素的释放，果园间种植物后，8月相对于5月土壤的营养元素大部分升高，其中土壤中铁在间种苜蓿、薄荷和生草后分别提高了134.93%、74.01%和78.55%，土壤中铜在间种苜蓿、薄荷和生草后分别提高了49.84%、21.17%和21.41%。在不同的种植历史下也会有差异，栽种过苜蓿的土壤再间种植物会加速土壤中镁矿物的分解(P<0.05)，而栽种过薄荷的果园土壤间种植物会提高土壤中锌的可利用性(P<0.05)。薄荷土壤间种苜蓿相较于薄荷土壤种植薄荷，在8月份可以提高土壤中44.50%铁和31.56%锰。对于土壤中的营养元素，植物物种和种植时间对铁和锰有交互作用。

图2 间种植物对果园土壤营养元素影响Fig.2 Effects ofintercropping on soilnutrient elements in orchard

2.3 苹果间种植物对土壤酶活性的反馈

果园间作芳香植物会对土壤pH产生影响，在Mb、Msc、Bm、Bb、Bsc处理中，随着定植时间的增长，降低土壤的pH值(F=95.202，P<0.001)，而苜蓿土中种植苜蓿不会影响pH。8月土壤相较于5月土壤，提高了土壤过氧化氢酶活性、脲酶活性，降低了转化酶活性，土壤种类以及植物物种没有与种植时间在统计学上有显著性的交互作用，因此并没有干扰这种现象。在8月份，套作处理Mb土壤中的脲酶活性显著高于Mn(P<0.01)、Msc(P<0.001)，套作处理Bm土壤中的转化酶活性显著高于Bb(P<0.01)、Bsc(P<0.01)。

图3 间种植物对果园土壤pH和酶活性影响Fig.3 Effects of intercropping on soil pH and enzyme activities in orchard

2.4 苹果园间种植物根系分泌物介导植物与土壤理化指标反馈

图4中使用偏最小二乘法分析可以寻找到处理组间的区别，找到差异代谢物，在PLS-DA得分图中，可以看出薄荷和苜蓿的两组代谢物分离。接下来观察PLS-DA的VIP图，寻找到排名前15的差异代谢物，并得到其代谢物在不同组中浓度的高低。可以发现排名前15的差异代谢物中主要分为糖类、醇类、醛类以及酸类，其中海藻糖VIP得分最高，差异最明显的前4种代谢物在苜蓿土中浓度要高于薄荷土中的浓度，1-十七醇和恶12-十八碳烯酸在薄荷土中浓度高于苜蓿土中的浓度。值得注意的是前15种差异中阿魏酸和苯甲酸为酚酸类物质，并且在苜蓿土中为高浓度。

3 讨 论

本研究结果表明，薄荷土中种植苜蓿可以提高土壤全磷、全钾、速效磷、速效钾含量，加速土壤中铁、锰转化为可利用态，增加土壤中转化酶活性，苜蓿土中种植薄荷同样会提高土壤中营养物质的周转，并且能增加土壤中脲酶活性。因此在果园间作栽培中，使用轮作制度可以改善土壤肥力，提高土壤营养元素分解，激活土壤酶活性。并且本研究发现，选择性的间种植物相较于自然生草处理优于果园土壤的充分利用。

在苜蓿土中种植苜蓿，会降低了土壤全磷、全钾，且不会改善碱性土壤的高pH，这表明土壤类型也影响着下一代间种植物对土壤养分的吸收与利用，其中起到关键作用的是植物的根系分泌物。有研究表明，苜蓿的自毒物质主要是香豆素、绿原酸、水杨酸等酚类物质和皂甙两大类，苜蓿根系相较于薄荷根系，分泌了高浓度的酚酸类物质阿魏酸和苯甲酸，阿魏酸和苯甲酸会显著抑制苜蓿种子萌发[13]。

左图为PLS-DA得分图，是一种监督性分类判别模型，右图为PLS-DA的VIP(Variable Importance in Projection)图，很坐标为VIP值，纵坐标为排名前15的差异代谢物，颜色编码反应此代谢物在不同组中浓度高低 The left picture shows the PLS-DA score map, which is a supervised classification discriminant model. The right picture shows the PLS-DA VIP (Variable Importance in Projection) graph. The very coordinate is the VIP value, and the ordinate is the top 15 difference. Metabolites, color-coded to reflect the concentration of this metabolite in different groups图4 根系分泌差异代谢物Fig.4 Root secretion differential metabolite

试验中间种植物与果园的土壤反馈可能不仅仅是由于根系分泌物产生影响，在取土过程中，土壤中还残留上一代苜蓿草根部残体，由经过微生物腐败降解，释放或激活了某些化学物质，这些化学物质可能具有不同的植物毒性作用。土壤中的植物材料，也可以通过影响例如营养素活化、酸碱度或微生物活性来产生间接抑制作用[14]。

综上所述，在盆栽试验中，模拟果园多年间种植物对果园土壤的反馈作用，发现轮作使得果园土壤肥力上升，加速土壤有效态营养元素转化，提高土壤酶活性。连作紫花苜蓿会使土壤全磷、全钾分别下降23.30%，33.63%，并且对土壤矿质营养转化产生影响，根据紫花苜蓿和香薄荷根系差异分泌物鉴定，发现差异分泌物主要由糖类、醇类、醛类以及酸类组成。这些结果表明，在果园间种植物物种的选择和合理的种植历史会提高果园土壤肥力。