超高效液相色谱-串联质谱法检测扶正解毒散剂中非法添加物喹乙醇、乙酰甲喹

章安源,章安雯,牛华星,陈 玲*,张 琦

(1.山东省兽药质量检验所，山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南 250022； 2.枣庄职业学院，山东枣庄 277100)

喹乙醇、乙酰甲喹属于喹噁啉类合成抗菌药，具有广谱抗菌活性，促进动物生长。因此被广泛地用作抗菌促生长剂和提高饲料转化率制剂[1-3]；为保障动物产品质量安全，维护公共卫生安全和生态安全，农业农村部组织决定自2019年5月1日起，停止经营、使用喹乙醇等3种兽药的原料药及各种制剂[4]。

但鉴于少数不法兽药企业在利益的驱动下，在清热解毒类和促生长类兽用中兽药散剂中违规添加。采用液相色谱法检测喹乙醇，样品前处理过程繁琐,检出限也较高,缺乏针对性的检测方法，给养殖户造成严重经济损失；另一方面也会给人造成食源性细菌耐药性等的潜在危害[5]。

研究参考了饲料残留的检测方法[6-7]，首次建立了扶正解毒散剂中非法添加物喹乙醇、乙酰甲喹的超高效相串联质谱法，此方法可以作为非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的定性、定量测定。

1 材料与方法

1.1 仪器 AE-240电子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)；LC-30AD高效液相色谱仪(岛津)，SCIEx四极杆带电离喷雾源串联质谱仪(AB公司)； KQ - 250DB超声仪(昆山市超声仪有限公司)；高速冷冻离心机(日立公司)，0.22 μm的滤膜为Waters 公司。

1.2 药品及试剂 喹乙醇，批号H0061103，含量99.5%，乙酰甲喹，批号H0111008，含量99.6%，购自中国兽医药品监察所。甲酸、乙腈(色谱纯，Merk，德国)；超纯水。高纯氮，高纯氩(纯度均为99.99%，济南德阳气体有限公司)。

1.3 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLCR BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相A：乙腈；流动相B：水溶液(0.1%甲酸)；流速：0.4mL/min；进样量：5 μL；柱温：35℃。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Progam of gradient elution

1.4 质谱条件 电喷雾离子源；正离子扫描(ESI+)；多反应监测(MRM)；离子喷雾电压：5500；离子源温度：500 ℃；帘气：20；雾化气：50；加热气：50；测试药物定性、定量离子对及对应的去簇电压和碰撞能量见表2

表2 质谱测定参数

1.5 样品制备

1.5.1 阴性样品 扶正解毒散，来源：山东天利和生物工程有限公司；批号20181101。

1.5.2 标准储备液的制备 精密称取喹乙醇、乙酰甲喹10 mg(准确至0.01 mg)，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。-20 ℃冰箱保存，贮存期3个月。

1.5.3 样品溶液的制备 精密称取1.5.1项下扶正解毒散0.2 g，置30 mL离心管中，加20 mL 60%乙腈，40 ℃水浴超声处理10 min，5000 r/min离心15 min，滤过，精密量取续滤液1 mL，置50 mL容量瓶中加初始流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得空白基质溶液。待测样品以上法处理，作为UPLC-MS/MS供试品溶液。

1.5.4 基质匹配标准储备溶液的制备 精密量取标准储备液1 mL，置100 mL容量瓶中，加空白基质溶液稀释至刻度，摇匀，从中精密量取1 mL置50 mL容量瓶中，加空白基质溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得100 ng/mL的基质匹配标准储备溶液。

1.5.5 标准曲线的绘制 上述储备液(1.5.2)用初始比例流动相稀释，制成5、7.5、10、15、20、50、100、200ng/mL的溶液，并绘制标准曲线。

1.5.6 阳性添加样品的制备 精密称取16、20、24 mg喹乙醇、乙酰甲喹加入到阴性样品中配制成80、100、120 μg/mL的阳性添加样品，旋涡混匀，每种添加浓度制备3份平行样，每份样品至少进样2次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 线性考察 在选定的色谱条件下，使用梯度洗脱的方法，可以有效地分离各离子。上述储备液(1.5.2)用初始流动性稀释，配制成5、7.5、10、15、20、50、100、200 ng/mL的溶液，经高效液相色谱串联质谱仪测定后，以标准溶液中喹乙醇、乙酰甲喹定量离子峰面积为横坐标，标准溶液中相应的喹乙醇、乙酰甲喹浓度为纵坐标，绘制标准曲线。如图所示喹乙醇、乙酰甲喹在5～200ng/mL的范围内标准曲线方程分别为Y=0.0108X-26.509，Y=0.0032X-24.2282，其相关系数分别为R2为0.9984，R2为0.9995，线性良好。见图1，图2。

图1 喹乙醇标准曲线Fig 1 Standard curve of olaquindox

图2 乙酰甲喹标准曲线Fig 2 Standard curve of mequindox

2.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液2 μL，连续进样6次。以峰面积计算，得出喹乙醇、乙酰甲喹的RSD分别是3.02%,2.16%。表明仪器精密度良好，符合检测要求。

2.3 重复性试验 同批供试品(批号为 20180201，山东某兽药生物科技有限公司提供)，按1.5.6项下制备6份样品溶液，喹乙醇、乙酰甲喹含量的RSD分别是2.92%,2.66%，说明该方法重现性好，含量稳定。

2.4 稳定性试验 取1.5.6项下同一供试品溶液(批号：20180201)，室温下每隔4 h连测6次，进样体积2 μL，喹乙醇、乙酰甲喹峰面积RSD分别为0.88%，0.92%、0.85%，表明本制剂在制备后的24 h内成份较稳定。

2.5 检测限和定量限 25 μg/mL喹乙醇、乙酰甲喹对照品溶液信噪比(S/N)≥3，确定为方法的检出限。50 μg/mL喹乙醇/乙酰甲喹对照品溶液显示信噪比(S/N)≥10，作为此方法定量限。

2.6 方法选择性的验证 选择20个空白样品，按照优化条件进行处理后上机测定，未发现有假阳性结果，表明该方法的选择性良好。

2.7 回收率试验 扶正解毒散中添加喹乙醇，乙酰甲喹，液质分离良好，无干扰，添加浓度80、100、120 μg/mL，批内批间变异系数均小于10%，阳性添加样品的回收率在90%～103%见表3。

表3 回收率试验结果(n=9)Tab 3 Result of recovery for olaquindo and mequindox

方法批内相对标准偏差<10%，批间相对标准偏差<10%。

空白样品、对照溶液及阳性添加样品的液相色谱-串联质谱谱图见图3～图5。

图3 100 ng/mL对照溶液提取离子色谱图Fig 3 Extraction ion chromatograms of the contrast solution

图4 空白样品特征离子质量色谱图Fig 4 Extraction ion chromatograms of the blank sample

图5 100 ng/mL阳性添加样品特征离子质量色谱图Fig 5 Extraction ion chromatograms of the positive added sample

3 讨论与结论

3.1 流动相的选择 实验选择甲醇(0.1%甲酸)和乙腈(0.1%甲酸)为流动相A，分别考察了甲醇-水体系和乙腈-水体系分离情况，摒弃了乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(12∶88)作为流动相[8-9]，降低了色谱柱因磷酸盐易堵的风险。不断调整流动相比列：甲醇和乙腈由30%下降到15%[10]，最终选择了5%乙腈(0.1%甲酸)为流动相A，不仅能使喹乙醇、乙酰甲喹很好的分离，其特征离子质量色谱图的峰形和分离度比好，而且降低了检测成本，有机试剂使用量较少，保护了环境。

3.2 质谱条件的优化 选择了多反应监测模式，正离子扫描，并不断优化了质谱条件：对离子源温度、去簇电压，碰撞能量等参数进行优化，使药物的离子化程度达到最佳状态。计算结果采用外标法，标准曲线线性良好；样品处理简单，经过1000倍的稀释，上机检测杂峰极微，无干扰，分离度好。

3.3 样品提取溶剂、处理方法及的选择 为确保药品中有效成分全部溶解，保证药物临床有效性，分别用甲醇、乙腈、60%乙腈、5%乙腈对不同批号的样品稀释并超声提取。直接采用甲醇、乙腈溶解样品，得到供试品溶液杂质成分多，采取HLB固相萃取柱净化样品[11]；过程繁琐，上机后柱效差，所得目标峰峰型、分离度均不理想。样品60%乙腈超声提取15分钟，离心后过滤上机，杂质干扰少，峰形对称，喹乙醇、乙酰甲喹回收率较高。基质匹配标准溶液采用空白基质溶液定容，空白基质溶液在与喹乙醇、乙酰甲喹对照品相同保留时间处，均无色谱峰出现，证明在很大程度上基质效应小，实验准确度高。

3.4 结论 喹乙醇、乙酰甲喹在兽药质量标准中的质量控制方法主要为紫外分光光度法，专属性不强，且中药组分的干扰较大，故选择高效液相色谱串联质谱方法检测中兽药散剂中违规添加的喹乙醇、乙酰甲喹[10]；喹乙醇是一种基因毒剂、生殖诱变剂，具有致突变、致畸和致癌性。建立其它中兽药单方或复方制剂的喹乙醇、乙酰甲喹的检测方法，对保障人民健康，具有重要的实际意义。

综上所述，MS串联可解决扶正解毒散中非法添加物喹乙醇、乙酰甲喹的定性、定量问题，消除基质干扰，使检测结果更为准确可靠。检测限低，灵敏度高；适合批量样品分析。其次运行时间短，比文献HPLC方法节省了大量流动相[12-13]，经济可行。为治理整顿中兽药中添加违禁药物，严厉打击违法行为，提供了检测依据。