蛋白质精氨酸甲基化转移酶与哺乳动物生殖

王艺琛，高辉，张昌军，刁红录

(1.十堰市人民医院(湖北医药学院附属人民医院)生殖医学中心，十堰 442000；2.湖北医药学院生物医药研究院，十堰 442000；3.湖北医药学院生物医学工程学院，十堰 442000)

哺乳动物生殖系统中的调控网络复杂而精确，任何一个环节都不容忽视。组蛋白翻译后修饰在其中有着必不可少的作用。蛋白质精氨酸甲基化是表观遗传水平重要的修饰方式之一，它参与了配子发生、性激素调控、胚胎发育以及生殖系统疾病发生发展等活动。本文对精氨酸甲基化修饰活动进行了简单的总结，旨在对研究者们提供一定参考。

一、PRMTs概述

翻译后修饰(PTM)是表观遗传学中的核心部分，而组蛋白甲基化在其中有着重要的作用，其中决定组蛋白甲基化位点的蛋白质精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferases，PRMTs)已被证明在人体的各个组织中广泛分布。PRMTs在前体RNA的剪切、细胞信号转导、DNA的修复、mRNA的翻译以及细胞分化过程中有重要作用[1]。PRMTs作为一类甲基化酶，它可以催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyme-thionine，SAM)上的甲基转移到精氨酸的胍基上，并产生甲基精氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸。已有研究证明，哺乳动物体内有三种PRMTs存在，分别为Type Ⅰ(PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT4/CARM1、PRMT6 和 PRMT8)，Type Ⅱ(PRMT5 和 PRMT9)以及Type Ⅲ(PRMT7)[2]。Ⅰ型和Ⅱ型可以分别催化中间产物MMA生成非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine，aDMA)和对称二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine，sDMA)，而Ⅲ型只能催化组蛋白生成单甲基精氨酸(Monomethylarginine，MMA)(图1)[1]。MMA，aDMA与sDMA是哺乳动物体内存在的三种主要甲基精氨酸形式[1，3]。

图1 蛋白质精氨酸甲基化转移酶作用底物及产物[1]

目前已知PRMTs可以甲基化的具有研究意义的位点有H3R2、H3R8、H3R17、H3R26和H4R3，这些位点具有激活或抑制染色质功能的作用[2]。PRMTs家族中所有成员都含有大约310个保守的氨基酸核心催化区域，有一些成员还含有特殊的结构，如含有SH3结构的PRMT2，含有锌指结构的PRMT3，含有TIM barrel结构的PRMT5以及含有重复TPR结构的PRMT9。值得一提的是，PRMT7和PRMT9都含有两个重复且连续的甲基转移酶片段，而其它成员只有一个催化中心，这可能是因为基因自主复制的原因[3]。Tudor结构域是一个保守的含有50个氨基酸的多肽，甲基化后的精氨酸与其结合的能力增强了，目前已知的主要可以被甲基化的含有Tudor结构域的多肽有活性运动神经元(Survival of motor neuron，SMN)，剪切因子(Splicing factor 30，SPF30)以及Tudor domain-containg protein1/2/3/6/9/11(TDRD1/2/3/6/9/11)[4]。

二、PRMTs在生殖中的功能

1.PRMTs与配子发生：配子形成的过程称为配子发生。配子包括雄配子和雌配子，雌、雄配子的发生都要经过三个时期，即增殖期、生长期和减数分裂期。原始生殖细胞(Primordial Germ Cell，PGC)是指产生雄性和雌性生殖细胞的早期细胞。PRMT5与生殖细胞决定基因(PR domain zinc finger protein 1，PRDM1)共同促进PGC的发生发育，通过促进Sm剪接体蛋白(a family of RNA-binding proteins)的甲基化并显著改变PGC的RNA剪接谱来调节基因表达。小鼠胚胎发育到第8.5天时，PRMT5在细胞中的表达从细胞质转移到细胞核，能够导致高水平的H4R3me2修饰。在精、卵结合后10.5 d，PRMT5通过抑制PGC的转座因子和调控RNA的正确剪切来应对DNA损伤，从而起到保护基因组完整性的作用，这两种依赖于PRMT5的保护机制能维持PGC的正常发生[5]。而在E11.5，PRMT5-BLIMP1复合物易位回到细胞质，随后H4R3me2修饰减少，此时DNA甲基化在PGC中达到基础水平。H4R3me2是一种抑制性组蛋白修饰，其中包括RNA剪接和p53所必需的神经祖细胞中的Sm蛋白。PRMT5催化的H2A/H4R3me2s修饰在早期PGC的LINE1长分散核元件1(Long interspersed nuclear element 1，LINE1)和凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)转座子上大量发生，PRMT5的失活会导致这种修饰减少，PGCs的凋亡，以及雄性和雌性不育[6]。精子的成熟要经历精原细胞、初级次级精母细胞以及精子细胞阶段，精氨酸甲基化在其中也扮演着重要的角色。 PRMT5主要在雄性小鼠睾丸的精母细胞中大量表达，而不是精子发生过程中的其他阶段。PRMT5敲除后，小鼠的初级精母、初级卵母细胞不能正常的进行减数分裂，二甲基化H4R3变少，而且其增殖也会变得异常。这说明PRMT5在生殖细胞发育中的功能可能是由H4R3me2介导的[7-8]。PRTM4在小鼠睾丸中高度表达。在精子发生过程中，PRMT4首先表达在精母细胞的胞质，而后表达在精子细胞的细胞核，这表明PRTM4主要在精子发生后期具有重要作用[9]。PRMT6作为剪切和修复DNA碱基的调节因子，可通过与DNA聚合酶形成复合物来刺激DNA聚合酶的活性。DNA碱基的切除修复在初级精母细胞和圆形精子细胞的发生过程中有着重要作用，而DNA聚合酶也被发现在减数分裂中参与染色体结合和重组过程。表明PRMT6可通过调节DNA聚合酶在减数分裂和重组中发挥作用从而影响精子的发生[10]。

2.PRMTs与受精：受精是卵母细胞和精子融合为一个合子的过程，受精过程包括卵母细胞激活、精子获能和两性原核融合三个主要阶段。当精子进入卵母细胞时，它必须经历依赖于母体因素以进行生化重塑。

精子头部的去致密化是由母核纤溶酶2(Nucleoplasmin 2，NPM2)进行的，它将鱼精蛋白释放到卵母细胞的细胞质中，为雄原核(pronuclei，PN)的形成做好准备。原核新核小体的组装依赖于母体组蛋白H3.3及其伴侣蛋白Hira(Histone cell cycle regulator，Hira)，这对于PN的形成至关重要。缺乏非对称二甲基化组蛋白H3R17me2a的H3.3不能参与PN的形成，说明Ⅰ型PRMTs对称二甲基化H3R17me2a修饰在受精早期可能起着重要的作用[11]。

3.PRMTs与早期胚胎发育：早期胚胎正常发育是维持妊娠的重要环节，包括受精后早期的细胞分裂，桑葚胚、囊胚的形成及胚泡植入子宫内膜等过程。任何影响早期胚胎发育的因素都可能导致胚胎发育缺陷。

胚胎干细胞对胚胎各个系统的正常发育是至关重要的。PRMT1能够甲基化富含甘氨酸-精氨酸的结构域，抑制小鼠胚胎成纤维细胞中PRMT1的表达会导致此类型结构域的低甲基化(如Sam68和MRE11等)，致使自发性DNA损伤，进而发生细胞周期进程延迟，染色体非整倍性和多倍体的出现，最终胚胎在E6.5死亡[12]。抑制PRMT1在神经系统中的表达，会导致小鼠出现了严重的神经性震颤并且在出生后两周内死亡。PRMT1缺陷小鼠神经系统内成熟少突胶质细胞大量减少，说明PRMT1可能对少突胶质细胞的成熟起着重要作用[13]。PRMT1小鼠血管内皮细胞特异性敲除小鼠在出生后15 d内死亡，主要原因是胚胎表面颞动脉血液灌注不良，3D成像显示血管分段且扩张成空腔[14]。PRMT3的缺失会导致胚胎在妊娠期间发育迟缓，主要原因是小鼠成纤维细胞胞质中核糖体蛋白rpS2(40S ribosomal protein S2，rpS2)的低甲基化[15]。PRMT4敲除小鼠在出生后不久死亡，可能是其胸腺细胞的发育停留在祖细胞阶段，而脂肪细胞的生成也有障碍，其体型较野生型小。PRMT4/ CARM1在早期神经元发育中也有重要作用，Sox1和NF1分别是参与维持早期神经元祖细胞和星形胶质细胞系平衡的基因，CARM1可以通过甲基化H3R17来调节Sox1和NF1的转录。此甲基化过程在发育后期对胶质谱系特异的miRNA启动子如miR10a、miR575和miR92a发挥进一步的调节作用[16]。CARM1可以调节卵裂球中组蛋白H3R17和H3R26的甲基化水平，这两种组蛋白的甲基化会促进小鼠植入前胚胎内细胞团的发生，这是表观遗传控制胚胎干细胞多能性所必需的[17]。在神经干细胞中选择性敲除PRMT5 同样会导致小鼠在出生后不久死亡，主要原因是PRMT5的缺失会导致Sm蛋白甲基化水平下降并且Mdm4(p53 regulator)前体RNA的合成异常会激活p53信号通路，从而引起细胞程序性死亡[18]。PRMT6敲除小鼠可以正常存活，但分离出来的胚胎成纤维细胞在体外却发生早衰，这可能是因为PRMT6缺失致使胚胎成纤维细胞在体外细胞周期停留在G0/G1期[19]。PRMT8是一种特异性表达在神经系统内的精氨酸甲基化修饰酶。它的缺失会扰乱了轴突或树突在发育中所需蛋白质的合成，这对视觉皮质回路的形成造成了不利影响从而使视觉下降或消失[20]。

围着床期信号调控网络精确，分子动态变化复杂，精氨酸甲基化活动也参与在其中。缺乏PRMT4胚胎细胞雌激素受体蛋白和NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)信号传导途径存在缺陷，并且雌激素应答的消除和一些ERα靶基因的表达也减少[21]。 受精卵中的PRMT5是母系遗传的，且PRMT5蛋白的表达在4到8细胞期之间被激活。在原始生殖细胞中，PRMT5蛋白在胚胎发育的4细胞阶段以及E8.5从细胞质转移至细胞核中。在胚胎植入后，PRMT5蛋白重新从细胞核转出至细胞质，主要在外胚层细胞中表达。这时的外胚层细胞属于相对休眠状态的滋养外胚层，PRMT5则启动DNA甲基化和RNA剪切活动[6， 22]。PRMT5在着床前后由细胞质转移至细胞核，并介导组蛋白甲基化活动，说明它在着床过程中可能起到了一定的作用。PRMT5敲除小鼠在E6.5停止发育，这可能是由于其囊胚期多能干细胞多能性的丧失而导致。进一步研究表明在PRMT5缺陷胚胎生殖细胞中H4R3me2s显着降低，而H3R2me2s的水平不变说明PRMT5可能通过调节H4R3me2s水平调节生殖细胞发育[23]。

敲除模型是研究早期胚胎发育的一个重要技术，PRMTs家族成员的敲除模型证明PRMTs无论是对组蛋白修饰、信号转导还是细胞周期都是必不可少的。因此，深入研究PRMTs影响发育的机制对生殖领域具有重要意义。

4.PRMTs与性激素受体：性激素调控在哺乳动物生殖中有着重要作用。性激素受体包括雄激素受体(AR)、雌激素受体(ESR)和孕激素受体(PGR)，性激素是经其受体通过上下级联信号传导而发挥生物学作用，所以性激素受体的正常表达对生殖系统中存在的信号转导有着重要的作用。雌激素的生物学作用是通过受体ESRα和ESRβ介导的，ESRα和ESRβ在细胞核中起着配体依赖型转录因子的作用。ESRα的甲基化是动态的和周期性的，在雌二醇(E2)处理过的细胞中，PRMT1可以瞬时甲基化ESRα内的精氨酸260(R260)DNA结合域。雌二醇可以通过控制ESRα，酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)和PI-3激酶的p85亚基(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)的复合物来快速激活雌激素受体细胞质途径，传导信号至下游使激酶MAPK和AKT活化来协调细胞增殖和存活。被甲基化后的ESRα可用于控制雌激素的快速生理反应，诱导复合物的解离并最终导致下游激酶活性的消失[24]。PRMT1的结合蛋白FOP在激活雌激素受体靶基因(Trefoil factor 1，TFF1)中起重要作用，FOP的敲除会导致雌激素受体的启动子被阻断。因此猜测FOP募集到启动子是激活雌二醇依赖性转录的关键蛋白[25]。PRMT2可增强雌激素受体ESRα、雄激素受体AR、孕激素受体PGR 、视黄酸核受体(retinoic acid receptor alpha，RARα)、过氧化物酶增殖激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的转录活性[26]。外源性雌激素也可以阻断PRMTs的甲基化活动，如他莫昔芬(Tamoxifen，Tam)可以抑制CARM1作为共激活因子的作用从而抑制雌激素受体的的活化[24， 27]。此外，雌激素ESRα受体的共激活因子的募集是有序的，ESR招募类固醇受体辅助激活因子3(steroid receptor coactivator-3，SRC-3)，和共激活因子p300/CBP与CARM1。CARM1的招募滞后于SRC-3和p300。CARM1的募集改变了已有的ERE/ESRα/SRC-3/p300复合物的结构组织。它诱导p300发生构象变化，增加其对组蛋白H3K18残基上p300的乙酰化，从而使H3R17残基甲基化以增强自身的转录活性[9， 28]。

AR是核受体(Nuclear receptor，NR)超家族的成员，在配体结合后转位进入细胞核并与DNA应答元件相互作用以调节靶基因转录。PRMT2的两末端在与AR结合的过程中分工不同，C末端负责与AR结合，而N-末端则负责转录的共激活[29]。AR的转录激活需要PRMT6的催化活性和AKT结构域精氨酸残基的甲基化参与。而PRMT6可以促进前列腺癌特异性抗原PSA(Prostate-specific antigen，PSA)和KLK2(kallikrein-2，KLK2)的转录，提示PRMT6可能通过调控AR下游靶基因的转录，从而促进前列腺癌的发生发展[30]。

5.PRMTs与不孕相关疾病：多囊卵巢综合征(PCOS)是生育期女性常见的女性内分泌紊乱和糖脂代谢异常的全身性疾病，是女性不孕主要原因之一。最近的一项研究表明，PCOS妇女血液循环中的aDMA浓度明显高于对照组，但提高血清雌、孕激素可以降低aDMA的浓度，并且可以降低胰岛素抵抗[31-32]。aDMA作为一氧化氮合酶(NO synthase，NOS)的内源性竞争性抑制剂可抑制NO 的合成，使NO/NOS 通路发生障碍、NO 合成减少。PRMT1、PRMT2和PRMT4的过表达会导致aDMA的合成大量增加，aDMA的积累会影响NOS和NO的合成，而过低的NO浓度会提高PCOS发生的机率[33]。

子宫内膜异位症是指有活性的内膜细胞种植在子宫内膜以外的位置而形成的一种女性常见妇科疾病，它是一种慢性疾病，异位的内膜造成不育和慢性疼痛。免疫组织化学证实CARM1蛋白在子宫内膜和卵巢中的表达下调，并根据月经周期表现出动态表达模式，在增生晚期和分泌中期表达较高，在分泌晚期表达较少[34]。在子宫内膜异位症发生15个月后，卵巢中PRMT1、PRMT2和PRMT8以及CARM1蛋白显著降低，提示精氨酸甲基转移酶的失调可能会导致良性和癌前疾病的发生，如细胞增殖减弱、异常细胞克隆和基因组不稳定等变化。而且，颗粒细胞和排卵前卵母细胞中CARM1的转录和蛋白质水平也显著降低[35]。

三、展望

虽然人们对精氨酸甲基化酶的结构和生化特性有了较深入的认识，但是对这些酶的生物学功能和其参与的调控网络还知之甚少，尤其是动物中精氨酸甲基转移酶的生物学功能以及其调控的生物学过程的分子机理还不清楚。基因的功能和生物学过程的进行是由染色质的状态决定的，组蛋白翻译后修饰在调节真核生物染色质的功能状态中起关键的作用。已有的结果证明精氨酸甲基转移酶可以甲基化组蛋白精氨酸位点。因此，对参与催化组蛋白翻译后修饰和随后的细胞表观遗传状态的精氨酸甲基转移酶的功能分子机制进行深入研究和解析将有助于人们进一步了解生物生长发育的调控和如何适应环境的。精氨酸甲基化转移酶在生殖系统中的功能，以及对生殖系统疾病发生发展的分子机制还需我们花费更多的努力及时间来探寻。