益气养阴方通过p53依赖AKT/NF-κB信号传导抑制肺癌细胞增殖研究

阮广欣，周 蕾

(上海中医药大学附属龙华医院 肿瘤科，上海 200030)

原发性支气管肺癌是严重危害人类健康的疾病之一，近年来成为因癌症死亡率最高的肿瘤[1]。中医益气养阴法是国医大师刘嘉湘教授以“扶正治癌”学术思想为指导的核心治则。多项临床研究表明，应用益气养阴法及其核心药物在缩小稳定病灶、抗肺癌转移、延长生存期及提高生存率等方面均显示出良好的疗效，同时在改善症状、提高生存质量、改善免疫功能等方面亦有良好的作用[2-5]。在药物作用机制方面，应用益气养阴法及其核心药物具有抑制肺癌细胞及干细胞增殖、促进细胞凋亡的作用[6-8]。本研究拟结合中医药治疗肺癌具有综合调节、多靶点的作用特点，对益气养阴法核心处方益气养阴方如何影响肺癌细胞增殖及存活的分子机制展开研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞系 人肺癌细胞株A549(p53野生型)、H1299(p53缺失型)，均购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。A549及H1299细胞培养液含有RPMI-1640(Gibco公司)，10%小牛血清和1%两性霉素，同时孵育于5% CO2，温度为37 ℃的培养箱中。

1.1.2 实验药物 益气养阴方由黄芪等12味中药配方(四川新绿色药业科技发展股份有限公司)组成，其中黄芪14.6 g、北沙参14.6 g、天冬4.9 g、麦冬4.9 g、石上柏14.6 g、石见穿14.6 g、重楼7.3 g、女贞子4.9 g、山茱萸4.9 g、仙灵脾4.9 g、葫芦巴4.9 g、绞股蓝4.9 g。

1.1.3 主要试剂 MTS试剂盒：CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)(普洛麦格公司，美国)；单克隆抗体：NFκB P65、Phospho-NFκB (Ser 536)、IKKα、 Phospho-IKKα/β、AKT、Phospho-AKT (Ser 473)、p53，(Cell signal公司，美国)；β-Actin(Novus公司，美国)；抗体稀释度为1∶1 000；Trizol试剂，Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen公司，美国)；SYBR Green PCR Master Mix(Bestar公司，德国)。

1.1.4 主要仪器 多功能酶标仪(BioTek，美国)；凝胶成像系统(GelDoc)(Bio-Rad，美国)；Nanodrop 2000核酸定量仪(Thermo，美国)；ABI Step One Real-time PCR仪(ABI，美国)；荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)；CO2细胞培养箱(TECAN，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 益气养阴复方颗粒以80 ℃蒸馏水100 mL震荡溶解60 min，冷却后用滤膜孔径为0.22 μm的Millex针头式过滤器，对益气养阴方溶液进行灭菌后装入无菌管，再用PBS稀释成梯度浓度以备用。

1.2.2 抑制细胞增殖研究 采用MTS法观察不同浓度益气养阴方对A549及H1299肺癌细胞增殖的抑制作用。取对数生长期的A549细胞及H1299细胞，以每孔3 000个细胞/100 μL接种于96孔培养板中，孵育24 h后分别加入梯度浓度的益气养阴方，以及空白对照组；37 ℃温箱中再培养24 h后，每孔加入MTS试剂(2 mg/mL)20 μL，孵育4 h后，用酶标仪以490 nm波长测定吸光度(OD)。计算出各组细胞增殖抑制率，并计算出益气养阴方作用于A549及H1299细胞的半抑制浓度数值(IC50)。细胞生长率计算公式：抑制率(%)= (对照组A490值-实验组A490值)/(对照组A490值-空白对照组A490值)×100%。

1.2.3 通过AKT/NF-κB信号通路抑制细胞存活研究 采用Western Blotting法检测：根据益气养阴方抑制肺癌细胞增殖IC50剂量，分别于不同时间点收集细胞(1×107)，用细胞裂解液(RIPA Buffer)收集细胞沉淀，于冰上提取细胞总蛋白，Brandford法测定蛋白含量。100 ℃变性5min，等量蛋白上样。进行SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜。5%BSA室温封闭2h，经与一抗NF-κB P65，Phospho-NF-κB(Ser 536)、IKKα、Phospho-IKKα/β、AKT、Phospho-AKT (Ser 473)、P53及β-tublin在4 ℃孵育过夜、二抗孵育后，加DAB显色，在凝胶成像仪上观察并进行光密度分析。

1.2.4 对A549肺癌细胞P53下游基因影响研究 采用RT-PCR检测：根据益气养阴方抑制肺癌细胞增殖IC50剂量，分别于不同时间点收集细胞(1×107)：RNA提取用Invitrogen公司TRIzol TM裂解细胞，加入氯仿分离溶解蛋白有机相，收集RNA组分水相，异丙醇沉淀RNA，依次经75%乙醇洗涤、DEPC水溶解，变性后以RNase free DNase消化可能残存的DNA，Nanodrop 2000核酸定量仪测定获得RNA浓度，并保存于-80 ℃备用。

RNA与Olig-dt-18在70 ℃变性5 min后，在逆转录酶的作用下42 ℃反应1h，获得cDNA。cDNA与相应基因特异引物在dNTP、酶缓冲液、氯化镁、Taq酶等条件下作PCR反应，反应条件初步设为：50 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 min，55 ℃退火1 min，60 ℃延伸90 s，共40循环；最后再延伸5 min以充分反应。具体反应条件可逐步摸索或用梯度PCR仪进行，并以GAPDH作为参照以ABI Step One Real-time PCR System定量分析基因的表达强度。实验扩增引物序列如下：

p53：F：5′-GTTCCGAGAGCTGAATGAGG-3′，R：5′-TTATGGCGGGAGGTAGACTG-3′；

Puma (BBC3)：F：5′-GAAGAGCAAATGAGCCAAACG-3′，R：5′-GGAGCAACCGGCAAACG-3′；

BAX：F：5′-GCCCTTTTGCTTCAGGGTTT-3′，R：5′-TCCAATGTCCAGCCCATGAT-3′；

BIM：F：5′-GATCCTTCCAGTGGGTATTTCTCTT-3′，R：5′-ACTGAGATAGTGGTTGAAGGCCTGG-3′；

GAPDH：F：5′-TCTACGAGTGGATGGTGCGTT-3′，R：5′-CGACTATGCAGTGACAGGTTGTG-3′

1.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 22.0软件进行分析，实验结果差异分析采用StudentT检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制情况

益气养阴方可抑制A549及H1299肺癌细胞的增殖，且该抑制作用呈现剂量依赖性。益气养阴方作用于A549肺癌细胞24 h的IC50值约为0.22 g/mL，作用于H1299肺癌细胞24 h的IC50值约为0.15 g/mL。见图1。

图1 益气养阴方对A549、H1299细胞增殖抑制作用

2.2 抑制细胞存活情况

益气养阴方可通过下调A549细胞AKT及其磷酸化蛋白的表达，从而下调AKT靶蛋白IKKα/β的磷酸化表达，并终导致下游蛋白NF-κB磷酸化下调，抑制肺癌细胞存活，且该抑制作用在益气养阴方干预24 h后最为明显，对磷酸化AKT及NF-κB蛋白表达抑制率分别为84.9%、91.8%；而对于H1299细胞，益气养阴方对于AKT及磷酸化、NF-κB及磷酸化的影响均不明显。结果提示，益气养阴方可以通过AKT/NF-κB信号通路抑制肺癌细胞存活，而这种抑制作用可能依赖于p53的表达。见图2、图3。

图2 益气养阴方对AKT/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

图3 益气养阴方对A549细胞磷酸化AKT及NF-κB蛋白表达的影响

2.3 增加肿瘤抑制蛋白p53表达

益气养阴方可以增加A549细胞p53蛋白的表达，且该作用呈现时间依赖性，在益气养阴方干预24 h后,p53蛋白表达明显增长率为214.8%。见图4。

图4 益气养阴方对A549细胞P53蛋白表达的影响

2.4 上调p53及下游基因BAX、Bim、Puma的表达

益气养阴方可以上调A549细胞p53及下游基因(Bcl-2家族基因)BAX、Bim、Puma表达，且该作用呈现时间依赖性。见图5。

注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

3 讨论

国医大师刘嘉湘教授首倡“扶正法”治疗恶性肿瘤，经过数十年的临床观察及研究，形成了完善的学术思想体系，其中益气养阴法是“扶正治癌”的核心治则，被广泛地应用于肺癌的治疗。体内外实验研究也揭示益气养阴法核心药物具有抑制肿瘤细胞增殖、浸润和转移，促进细胞凋亡的作用，并且可能通过降低耐药肿瘤细胞膜转运蛋白的表达而逆转肿瘤[6-7]；最近有研究表明益气养阴法可通过抑制耐药相关蛋白的表达，从而抑制Lewis肺癌Sca-1+干细胞亚群增殖[8]；通过逆转凋亡抵抗来逆转吉非替尼的获得性耐药[9-10]。但益气养阴法如何抑制肺癌细胞存活方面的研究则少有报道。

肿瘤是指细胞在致瘤因素作用下，基因发生改变，即癌基因与抑癌基因平衡被破坏，失去对其生长的正常调控，导致细胞异常增殖。因此，如何抑制细胞增殖、减少肿瘤细胞存活是肿瘤治疗的关键。蛋白激酶AKT通过调节下游多种信号传导可以影响肿瘤细胞增殖、凋亡以及细胞存活等，其中，AKT可以通过激活IKK及下游因子NF-κB是一条调节细胞存活、影响细胞存活的关键通路。研究表明抑制AKT/NF-κB信号传导通路能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖及存活[11-12]。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制，AKT正是通过磷酸化作用影响下游效应物如IKK、NF-κB等，最终激活肿瘤细胞存活[13]。p53是抑制肿瘤生长的关键因子和蛋白，NF-κB转录因子则为细胞应激反应中重要的多功能调节因子，两者之间存在相互作用。其机理之一是NF-κB通过调控p53的E3泛素连接酶Mdm2的水平(由IKKβ介导)，从而下调P53的稳定性，抑制DNA损伤引起的p53活化[14-15]。另外，p53 和NF-κB通路均受到PI3K-AKT信号的调控，在增加Mdm2核转位的同时下调 p53的表达，而AKT激活被抑制可使Mdm2在胞浆滞留，同时通过AKT介导的IKK磷酸化激活NF-κB信号通路，影响细胞存活[16]。因此，AKT、NF-κB以及p53均是影响细胞生长及存活的关键转化因子和蛋白，也被视作抗癌药物作用的效应靶点。本研究结果显示，益气养阴方可以通过下调AKT/NF-κB信号通路抑制肺癌细胞增殖与存活，且抑制作用与p53表达与否密切相关。

p53作为肿瘤抑制因子的功能，主要是通过调控其下游靶基因的表达，从而实现维持基因组的稳定、避免突变发生的功能。Bcl-2家族基因是p53下游重要的靶基因，是控制线粒体致凋亡因子释放的主要调节因子，主要包括促凋亡因子Bax、Bim、Puma[17-20]。由于DNA受损而使肿瘤抑制基因p53活化，上调Bcl-2家族中细胞促凋亡前蛋白Bax、Bim、Puma的表达，进一步导致线粒体内外膜间凋亡前物质细胞色素C和Smac/DIABLO的释放，从而启动线粒体介导的细胞凋亡，即内在途径(线粒体途径)[21]。

本研究结果显示益气养阴方通过上调p53及其下游基因BAX、Bim、Puma的表达促进肺癌细胞凋亡，从另一方面诠释了既往研究所得到的益气养阴方具有促进肺癌细胞凋亡的作用及途径。本研究发现，肿瘤抑制因子p53可能是中医益气养阴法影响肺癌细胞周期变化的关键靶点之一，为以后开展进一步临床及机制研究提供了新的角度和思路。