碳酸钠对牛肉嫩化效果及品质的影响

郝婉名，祝超智，赵改名*，韩明山，孟子晴，王可，李苗云

1(河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州，450003)2(通辽综合试验站，内蒙古 通辽，028000)

牛肉是世界第三消耗肉品，约占肉制品市场的25 %，仅落后于猪肉和家禽[1]。牛肉富含丰富的蛋白质、氨基酸和B族维生素，且具有低脂肪、低胆固醇等特点[2]，中医中也有“黄牛肉，补气，与绵黄芪同功”的说法，意思是常吃牛肉可以补中益气、滋养脾胃，有利健康。因此，随着人们生活水平的提高，牛肉成为一种追求营养健康的消费者的理想选择。但目前市场上售卖的牛肉产品普遍存在肉质硬、嫩度差等缺点，严重影响肉制品品质，为了改善这些缺点，牛肉在生产加工过程中需要经过嫩化处理。

碱法嫩化是一种传统的嫩化工艺，中国自古以来就有在炖煮牛肉中加入纯碱来提高牛肉嫩度的做法。很多研究证实碱性物质被用于肉类腌制中起到很好的嫩化作用，如磷酸盐和Na2CO3质量比1∶8复配而成的腌制剂对重组牛排有很好的嫩化效果[3]；NaCO3与菊粉共同作用能有效改善重组鸡排嫩度和保水性[4]；李劼等[5-6]分别把NaCO3和NaHCO3溶液涂抹在牛肉上进行腌制来研究碱对酱牛肉的嫩化作用，证实了碳酸钠和碳酸氢钠在提高肌肉pH值和保水性的同时，还可以降低蒸煮损失，改善牛肉制品的色泽。杨洪基等[7]研究了CaCl2、木瓜蛋白酶和Na2HCO3复合体系对原切牦牛排的嫩化作用，结果显示CaCl2质量浓度 10.19 mg/mL、木瓜蛋白酶活力 14.94 U/g、NaHCO3质量浓度 10.95 mg/mL、腌制时间 12 h时嫩化效果最佳。Na2CO3在猪肉中的应用表明，Na2CO3注射显著提高肌肉的pH值，有效减低了PSE肉出现机率[8]。但是这些研究通常采用涂抹或浸泡的方式进行嫩化，且研究内容仅仅局限于嫩化效果的研究，有关Na2CO3注射对牛肉嫩化效果的研究比较少，Na2CO3对牛肉肌纤维和结缔组织特性的研究未见报道。本研究探讨了Na2CO3注射对西门塔尔杂交牛肉的嫩化效果，筛选出合适的Na2CO3处理浓度，并探究Na2CO3注射对牛肉肌纤维及结缔组织的部分影响，期望为新型牛肉嫩化技术的研究提供理论依据，改善牛肉产品普遍存在的嫩度上的缺点，提高牛肉产品品质与价值。

1 材料与方法

1.1 材料

选择雄性西门塔尔杂交牛的臀肉作为研究对象。所有样品肉均来自宁夏夏华食品有限公司，年龄为18个月。样品经分割后在-30 ℃以下冷冻24 h后装入放有冰袋的保温箱中在6 h内带回实验室，于-30 ℃下冷冻保存。

1.2 仪器与试剂

仪器：Minolta CR-5型台式色差仪，日本KONICA MINOLTA公司；HI8424 型酸度计，德国HANNA公司；CU-420(HZW21)型恒温水浴槽，上海一恒科学仪器有限公司；PQ001MicroMR柜式NMR成像仪,上海纽迈电子科技有限公司；MM12B绞肉机,广东省韶关市大金食品机械厂；MJ-BL25C3型搅拌机，广东美的公司；MODEL 2000沃布剪切力仪，美国G-R公司;35172 BRUZ拍打均质机，法国AES Chemunex公司；UV-2600型紫外分光光度计，日本岛津企业管理(中国)有限公司。

试剂：Na2CO3(食品级)；KCl；K2HPO4；KH2PO4；MgCl2；双缩脲试剂；戊二醛；磷酸缓冲液；乙醇；氯仿；叔丁醇(以上试剂未特殊说明均为分析纯)。

1.3 实验步骤

工艺流程：

样品解冻→去除筋膜→注射嫩化→低温腌制→样品检测

1.4 样品处理

冷冻的原料肉在0～4 ℃环境中解冻24 h至完全解冻，将解冻后肉样剔去筋膜脂肪，顺着肌纤维方向切成2 cm×5 cm×5 cm的小块，肉样称重。用1mL注射器沿肌纤维的方向向不同肉样分别均匀注射Na2CO3。固定注射量8 %(样品质量的百分比)、腌制时间12 h，调节Na2CO3浓度0、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L。处理后的样品保鲜膜封口在0～4 ℃环境下放置12 h后，用吸水纸沥干表面的水分进行检测试验。

1.5 测定指标

1.5.1 pH值测定

参照国标使用便携式pH计进行测定。

1.5.2 剪切力测定

参考DESEFANI等[9]的方法进行适当的修改，将已处理的肉样切成1 cm×1 cm×2 cm大小，装入蒸煮袋于80 ℃恒温水浴锅中水浴加热至中心温度75 ℃,取出，冷却至室温，然后用沃布剪切仪测定每个肉块的剪切力值。

1.5.3 肌原纤维小片化指数(myofibrillar flake index,MFI)

参考李桂霞等[10]的方法，分别称取1 g搅碎的肉样，加入15 mL预冷后(4 ℃)的MFI(myofibrillar flake index)缓冲溶液(100 mmol/L KCl,11.2 mmol/L K2HPO4，0.8 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgCl2)冰浴匀浆(12 000 r/min，40 s)，每次10 s，中间间隔10 s；离心后(1 000 g，15 min，2 ℃)弃掉上清液；沉淀中加入2.5 mL的MFI缓冲溶液(已预冷)搅拌均匀，用纱布过滤去除结缔组织，用2.5 mL MFI缓冲溶液洗涤管内壁并过滤，合并滤液待用。采用BCA法测定滤液中蛋白质质量浓度，调整蛋白质质量浓度至0.5 mg/mL后，在562 mm处用紫外分光光度计测定吸光度值，将所得结果乘以200即可得MFI值。

1.5.4 胶原蛋白含量

羟脯胺酸含量的测定方法参考了KOLARL等[11]的方法，将原料肉在0 ℃温度下切成小块(0.5 cm3)，真空包装后的样品被放入70℃热水中保温30 min，搅碎待用；准确称取4 g搅碎的样品放入装有30 mL 3 mol/L的H2SO4溶液的烧瓶中，于105 ℃鼓风干燥箱中水解16 h；把水解产物过滤至250 mL容量瓶中，加水定容待用；移取一定体积(V)的上述溶液于250 mL容量瓶中，稀释至羟脯氨酸浓度在0.5～2 μg/mL；移取4 mL稀释后的溶液于装有2 mL氯胺T溶液的比色管中，混合后于室温下放置20 min,向比色管中加入2 mL显色剂，混合封口后放入60 ℃水浴锅中，加热20 min；取出比色管用流动水冷却3 min，在室温下放置30 min后于558 nm处用分光光度计测定吸收值。对照标准曲线计算溶液中羟脯胺酸浓度。样品中羟脯胺酸浓度按公式(1)计算,样品中胶原蛋白浓度根据公式(2)计算:

(1)

X2=9.75X1

(2)

式中：X1，试样中羟脯胺酸的含量(质量分数)，%；ρ，由标准曲线得到的水解产物中羟脯胺酸的质量浓度，μg/mL；m，样品质量，g；V，从250 mL容量瓶中吸取的滤液的体积，mL；，X2，试样中胶原蛋白的含量(质量分数)，%。计算结果保留小数点后两位。

1.5.5 肌原纤维微观结构

参考PALKA[12]的方法，取待测样品，切成2 mm×5 mm的小条，先用2.5 %。pH 6.8的戊二醛溶液浸泡过夜固定，之后用0.1 mol/L pH 6.8磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min。然后分别用体积分数50%、70%、80%、90%乙醇溶液进行脱水，每次10 min；再用100 %乙醇脱水3次，每次10 min，最后用氯仿脱脂1 h后依次用100 %乙醇-叔丁醇(体积比1∶1)溶液和叔丁醇各置换1次，每次15 min，用冷冻干燥仪对样品进行干燥，用扫描电镜对样品进行观察。

1.5.6 蒸煮损失测定

取2 cm×2 cm×2 cm大小的样品称的其质量为m1(g)，将其在90℃水浴锅中加热至中心温度达到75 ℃，取出后冷却至室温擦去表面水分称量其质量为m2(g)，蒸煮损失计算公式如式(3)：

(3)

1.5.7 色差测定

将冷冻保存的样品在空气中放置1 h后，选其新鲜面参考肖夏等[13]的方法，使用便携式色差计进行测定。光源D65，直径5 mm。其中L*表示亮度值，a*表示肉的红度值，b*表示肉的黄度值。

1.5.8 低场核磁共振

使用配备有PQ001-18mm头部的台式SLK100TD-NMR光谱仪记录CPMG衰减信号。TD参数使用CPMG序列的NMR弛豫谱与FANBOLA等[14]中先前优化的相同，分别为0/2和0.0和3.0，S的回波时间为0.249 ms，总计为10 000 E，平均16次扫描，循环时间3.6 s。每个样品测量前先进行修剪，去除外部脂肪。在室温环境中，对3份牛肉样品进行3次分析。

1.5.9 感官评定

选取10名经培训过的感官评定人员对不同处理的牛肉制成的牛排从色泽、香气、滋味、嫩度、多汁性、整体接受度和是否异常等7个方面进行评价，评定标准见表1。

表1 感官评定标准Table 1 Sensory assessment criteria

1.6 数据处理

实验数据采用Excel和SPSS 13.0进行分析，用Origin 8.0进行作图。每个实验数据测3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Na2CO3对牛肉pH值的影响

pH值是牛肉重要的品质指标，与保水性、嫩度、色泽等指标显著相关[15]。牛肉pH值随Na2CO3浓度变化的结果如表2所示。经Na2CO3注射嫩化的牛肉pH值显著高于未注射的空白样品(P<0.05)，且随着Na2CO3浓度的升高，牛肉pH值逐渐升高。这是因为Na2CO3是一种弱碱性的钠盐，它的水溶液可以显著提高牛肉的pH值。当Na2CO3浓度升高到0.40 mol/L时，牛肉的pH值达到6.81近中性(7.0)。此结果与李劼等[5]研究结果一致。

表2 不同浓度Na2CO3对牛肉pH值及剪切力的影响结果Table 2 Effects of different concentrations of sodium carbonate on pH value and shear force of beef

注：上标字母表示不同注射浓度间差异显著(P<0.05)。

2.2 不同浓度Na2CO3对牛肉嫩度的影响

嫩度是牛肉重要的品质指标，是影响消费者选择最重要的指标之一，一般用剪切力值来表示。由表2数据可以看出，添加Na2CO3能显著降低牛肉的剪切力(P<0.05)，提高牛肉嫩度；随着Na2CO3浓度的提高，剪切力出现显著的下降趋势；当Na2CO3浓度从0.30 mol/L升高到0.35 mol/L时，剪切力下降幅度最大(27 %)，当Na2CO3浓度达到0.35 mol/L后，牛肉剪切力的下降趋势趋于平缓。Na2CO3对牛肉嫩度的改善与提高牛肉pH值，增加肌肉保水性有关[16]，也有研究表明，Na2CO3提高牛肉嫩度可能与改变pH值，弱化结缔组织有关[17]。

2.3 不同浓度Na2CO3对牛肉肌原纤维小片化指数的影响

肌原纤维小片化指数(MFI)代表肌原纤维的分解程度[18]，是衡量肌肉嫩度的一个指标，MFI越大，说明肌原纤维内部结构受到破坏的程度越大，肉的嫩度越好[19]。图1结果显示，牛肉的肌原纤维断裂程度随Na2CO3浓度的增大而增加，特别是当Na2CO3浓度达到0.35 mol/L后，肌原纤维小片化指数激增，这是Na2CO3嫩化的主要机制之一。

图1 不同浓度Na2CO3溶液对牛肉肌原纤维小片化指数的影响Fig.1 Effects of different concentrations of sodiumcarbonate solution on the fragmentation index of beef myofibril注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.4 不同浓度Na2CO3对牛肉胶原蛋白含量的影响结果分析

结缔组织是肌肉中的次要组成部分，主要由胶原纤维构成，其主要成分是胶原蛋白。研究表明，肌肉的嫩度与肌束膜和肌内膜中胶原蛋白含量显著相关[20]。从图2的数据可以看出，Na2CO3注射能显著降低牛肉中胶原蛋白的含量(P<0.05)，当Na2CO3浓度达到0.35 mol/L后，牛肉中胶原蛋白含量虽然略有下降，但差异并不显著。常海军等[17]研究了3种若有机酸对肌束膜胶原蛋白含量的影响，发现经有机酸处理的样品肌束膜胶原蛋白含量远低于对照组。这可能与肌肉pH值与离子强度有关[21]。结合微观结构的观察可推断，牛肉胶原蛋白含量的降低与牛肉肌束膜的溶解也有关。肌肉的嫩度与胶原蛋白含量成反比，与可溶性胶原蛋白含量成正比[22]，由此可得到，Na2CO3能有效改善牛肉嫩度，且改善牛肉嫩度的机理与降低胶原蛋白含量，弱化结缔组织有关。

图2 不同浓度Na2CO3溶液对牛肉胶原蛋白含量的影响Fig.2 Effect of sodium carbonate solution with differentconcentrations on the content of beef collagen

2.5 不同浓度Na2CO3处理牛肉的肌原纤维微观结构

图3为经Na2CO3注射前后牛肉的微观结构示意图，其中图3-a、3-b、3-c、3-d、3-e为横截面示意图Na2CO3注射浓度依次为0、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L，由图3-a、3-b、3-c、3-d、3-e可以看出，随着Na2CO3浓度的增大，肌束明显变粗，肌纤维间的间隙增大，且包裹肌束的肌束膜逐渐溶解；图3-f、3-g、3-h、3-i、3-j为样品纵截面在500倍下的电镜图，同样可以明显看出肌束变粗，肌束膜逐渐溶解，肌纤维部分外露。这与我们前面得出的胶原蛋白含量下降的结果相符，也与常海军等[23]研究3种有机弱酸对肌束膜胶原蛋白和肌内膜胶原蛋白影响的研究结果相符。肌束的大小与肌束膜的厚度是影响肌肉嫩度的主要因素之一，肌束越粗，肌束膜越薄，肌肉越嫩[24-25]。

a-空白对照组横截面;b-0.25 mol/L Na2CO3处理组横截面;c-0.30 mol/L Na2CO3处理组横截面;d-0.35 mol/LNa2CO3处理组横截面;e-0.40 mol/L Na2CO3处理组横截面;f-空白对照组纵截面;g-0.25 mol/L Na2CO3处理组纵截面;h-0.30 mol/L Na2CO3处理组纵截面;i-0.35 mol/LNa2CO3处理组纵截面;j-0.40 mol/L Na2CO3处理组纵截面图3 不同浓度NaCO3注射牛肉肌原纤维微观结构Fig.3 Microstructure of beef myofibrils injected with sodiumcarbonate at different concentrations

2.6 不同浓度Na2CO3对牛肉保水性的影响

蒸煮损失是体现肉类保水性的重要指标，可以体现肌肉保持水分的能力。不同浓度Na2CO3对牛肉蒸煮损失的影响结果如图4所示，随着Na2CO3浓度的增加，牛肉的蒸煮损失显著下降(P<0.05)，保水性增强,肌肉的保水性与pH值密切相关[26]。肌原纤维蛋白质的等电点约为5.2～5.4，未注射Na2CO3溶液的空白牛肉样品pH为5.5，略高于蛋白质等电点，随着Na2CO3注射浓度的提高，牛肉pH值逐渐偏离等电点提高。随着肌肉pH值升高且逐渐偏离肌原纤维蛋白质等电点(5.0～5.2)，蛋白质表面负电荷增加，形成了更多与水分子结合的氢键位点，肌原纤维蛋白吸水膨胀；同时随着负电荷的增加，蛋白质分子间的静电斥力增加，引起肌丝的相互排斥，肌原纤维膨胀变粗，肌纤维间的间隙增大，更多的水被保留下来[27-28]。

图4 不同浓度NaCO3溶液对牛肉保水性的影响Fig.4 Effect of different concentrations of sodiumcarbonate solution on water-holding capacity of beef

2.7 不同浓度Na2CO3对牛肉色泽的影响

色泽是影响消费者选择肉制品最直观的指标，受到很多因素(如保水性、pH值等)的影响[29]。图5为牛肉色泽随Na2CO3浓度变化的关系。由图5可以看出随着Na2CO3浓度的增加，牛肉的亮度值(L*)逐渐升高，当Na2CO3浓度为0.40 mol/L时，L*值最高，浓度为0.35 mol/L时，L*值次之且两者之间没有显著性差异(P>0.05)；牛肉的红度值(a*)随Na2CO3浓度的增加而降低，这说明高浓度Na2CO3在一定程度上会影响肉色；黄度值(b*)随着Na2CO3浓度的增大而减小，但各个样品b*值之间没有显著性差异(P>0.05)，因此不建议使用高浓度Na2CO3对牛肉进行处理。

图5 不同浓度的Na2CO3溶液对牛肉色泽的影响Fig.5 Effect of sodium carbonate solution ofdifferent concentration on beef color

2.8 不同浓度Na2CO3对牛肉横向驰豫时间的影响结果分析

低场核磁共振横向驰豫时间是反应样品中水分迁徙的一个重要指标，通常用结合水(T21)、不易流动水(T22)和自由水(T23)来表示[30]。由图6可以看出，结合水的横向弛豫时间T21与峰面积比例都没有显著变化；添加了Na2CO3的样品的不易流动水的横向弛豫时间T22显著增大，且随着Na2CO3浓度的增大而持续向右偏移，这说明添加Na2CO3后样品中不易流动水的组织结合比较疏松，移动性增强；但从峰面积比例上看，随着Na2CO3浓度的增加，样品不易流动水的峰面积比例显著增加，当Na2CO3浓度达到0.35 mol/L时峰面积比例最大，随后，峰面积比例减小。这可能是因为胶原蛋白变型溶解形成凝胶，阻止了不易流动水从肌纤维中流出形成自由水；添加Na2CO3样品的自由水横向弛豫时间及比例同样显著增大，则可能是因为样品pH值远离蛋白质等电点增大，蛋白质表面负电荷增多，肌纤维间斥力增强，导致纤维间隙变大，可以容纳更多的自由水[31]。

图6 不同浓度Na2CO3溶液注射后牛肉的NMR结果Fig.6 NMR results of beef after injection of sodiumcarbonate solution of different concentrations

2.9 感官评价

感官分析是体现产品品质最直观的指标，可以清楚地表明消费者对产品的接受程度。表3数据分析可得随着注射浓度的增大，消费者对于产品的色泽接受度是持续下降的，这说明Na2CO3在一定程度上会影响牛肉的色泽。消费者对于牛肉香气的评定没有呈现出一种显著的规律，这说明Na2CO3对于牛肉香气几乎没有影响。滋味、嫩度和多汁性是影响牛肉品质的重要指标，由表3数据可以看出，这3种指标都随着Na2CO3浓度的增大而有显著的提高(P<0.05)，当Na2CO3浓度达到0.35 mol/L后，滋味、嫩度和多汁性评分虽然略有提高，但与0.35 mol/L时没有显著变化(P>0.05)。添加Na2CO3后，消费者对牛肉的整体可接受度是显著上升的(P<0.05)。

3 结论

Na2CO3注射能有效改善牛肉嫩度，提高牛肉保水性。浓度为0.35 mol/L的Na2CO3嫩化效果较好，且对牛肉品质影响较小。Na2CO3可以使肌肉pH值偏离等电点提高从而提高保水性，加大肌纤维之间的空隙；破坏肌纤维结构，使肌纤维小片化指数增加；改变结缔组织结构，降低胶原蛋白胶联，这是Na2CO3嫩化作用的主要机理。Na2CO3嫩化效果显著、安全无害、成本低廉，是一种前景优良的新型嫩化剂。研究Na2CO3注射对牛肉嫩化效果及对肌纤维与结缔组织的影响，为新型牛肉嫩化技术的研究提供了参考和理论依据。

表3 不同浓度Na2CO3溶液注射后牛肉的感官分析结果Table 3 Sensory analysis of beef after injection of sodium carbonate solution of different concentrations

注：上标字母表示不同注射浓度间差异显著(P<0.05)。