Six1和MTDH在人脑胶质瘤中的表达、临床病理特征及预后的相关性分析

付 苏，蒋 艳，樊朝凤，段丽娟

(四川大学华西医院，四川成都 610041)

人脑胶质瘤是临床上较为严重的疾病，其恶性程度较高，术后易复发，预后较差。全球每年约有18.9万新发患者，并有14.2万患者死亡，严重影响人类的健康[1-2]。为了改善患者预后，提高生存率，尽早诊断并给予有效治疗就显得尤为重要。因此，探索更多与患者临床病理特征及预后相关的生物标志物具有重要的临床意义。有研究结果显示，Six1在宫颈癌组织中表达上调，能够促进恶性肿瘤的发生、发展[3]。Six1蛋白是属于Six同源盒基因家族的成员之一，作为转录因子，不仅能够参与胚胎细胞的发育，还能够调节癌细胞的启动与转移[4]。有研究表明，异黏蛋白(MTDH)在直肠癌组织中表达高于正常，并与肿瘤的分化、转移密切相关[5]。MTDH属于星型细胞上调基因-1的表达产物，是一种胞质蛋白，主要分布核周胞质，近年发现MTDH与多种肿瘤的形成、侵蚀、发展密切相关[6-7]。目前，人脑胶质瘤的形成与发展仍需进一步研究。因此，本次研究主要是采用免疫组化法检测150例人脑胶质瘤中Six1、MTDH的表达与临床病理特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2012年12月至2016年12月收治的150例脑胶质瘤患者作为研究对象，并根据病理检查与临床资料将150例胶质瘤组织作为研究组，同时选择60例非肿瘤脑组织作为对照组。研究组男性78例，女性72例，年龄10～71岁，平均(52.21±5.50)岁。对照组男性32例，女性28例，年龄11～72岁，平均(53.22±5.47)岁。2组患者的年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)；并按照2007世界卫生组织神经系统肿瘤分级标准诊断[8]分为Ⅰ级45例、Ⅱ级40例、Ⅲ级33例、Ⅳ级32例。纳入标准：(1)符合胶质瘤的诊断标准[9]；(2)无肥胖以及糖尿病代谢者；(3)获得患者及家属的知情同意，并签署知情同意书；(4)术后早期复查，已证实肿瘤全切或次全切；(5)术前未进行放疗、化疗治疗者。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤、严重器官疾病者；(2)严重肝肾功能不全、血液系统疾病者；(3)术后再次手术、未顺从随访者；(4)既往精神病史者。本次研究已获得医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂 兔抗人Six1单克隆抗体购自美国Sigma公司；鼠抗人MTDH单克隆抗体购自美国Abnova公司；免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自中国福州迈新生物技术有限公司。

1.2.2采用免疫组化法检测Six1、MTDH蛋白表达 采用免疫组化法进行免疫组织化学染色，使用10%福尔马林将标本常规固定，石蜡包埋，切片后进行脱水，使用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶时间30 min，再使用乙二胺四乙酸高压抗原修复，封闭30 min，加入稀释浓度为1∶500的一抗，4 ℃孵育过夜。再分别加入二抗，孵育25 min，最后使用DAB显色试剂盒显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，自来水返蓝，蒸馏水洗涤，脱水、透明封片。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白组对照。

1.2.3结果判定[10]每张切片随机选取5个高倍镜视野，并根据细胞染色强度与阳性细胞百分比进行判断，采用染色指数反映目的蛋白的表达水平。(1)根据阳性细胞染色强度：无着色为0分；黄色为1分；棕色为2分；棕褐色为3分。(2)根据阳性细胞百分比：<5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分。(3)染色指数=将阳性细胞百分比例与着色强度评分相乘判断结果，具体标准为：0分为阴性表达(-)，≥1分均为阳性表达，1～2分为低表达(+)，3～4分为中表达(++)，6～9分为高表达(+++)。免疫结果由高年资的病理医师共同完成。

1.3随访 采用电话或者上门进行随访，随访时间为确定病理日开始至2018年12月30日截止，每3个月随访一次，随访时间为3-72个月，以患者发生转移或死亡为终点。

2 结 果

2.12组Six1、MTDH蛋白表达水平比较 研究组Six1、MTDH蛋白阳性表达率分别为65.33%(98/150)、63.33%(95/150)，对照组Six1、MTDH蛋白阳性表达率分别为33.33%(20/60)、28.33%(17/60)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

2.2脑胶质瘤Six1、MTDH蛋白表达和临床病理特征的比较 Six1、MTDH蛋白表达在脑胶质瘤患者的年龄、性别、病理类型、病理学分级以及肿瘤直径之间差异无统计学意义(P>0.05)，但与脑胶质瘤患者的分化程度差异有统计学意义(P<0.05)，并且当肿瘤分化程度越低时，Six1、MTDH蛋白阳性表达率越高(P<0.05)。见表2。

2.3脑胶质瘤中Six1、MTDH蛋白表达的相关性 采用Spearman等级相关分析法分析蛋白表达的相关性，结果显示在脑胶质瘤患者中Six1、MTDH蛋白表达呈正相关(r=0.354，P<0.05)。

表1 2组脑胶质瘤Six1、MTDH蛋白表达水平比较[n(%)]

表2 脑胶质瘤患者Six1、MTDH蛋白表达与临床病理特征的比较

2.4脑胶质瘤患者的预后生存情况 所有研究对象在病理确诊开始至随访结束存活3-72个月。脑胶质瘤患者平均中位生存期36个月，其中Six1阳性表达和阴性表达患者的中位生存期分别为21个月、44个月，中位生存期比较差异有统计学意义(χ2=22.872，P<0.05)；MTDH阳性表达和阴性表达患者的中位生存期分别为19个月、45个月，中位生存期比较差异有统计学意义(χ2=24.361，P<0.05)。见图2、3。

2.5影响脑胶质瘤患者预后的单因素分析 经单因素分析得出：病理学分级越高、肿瘤低分化、Six1阳性、MTDH阳性表达的患者其生存时间均明显缩短(P<0.05)。见表3。

注：A表示Six1在非肿瘤脑组织中阴性表达；B表示MTDH在非肿瘤脑组织中阴性表达；C表示Six1在脑胶质瘤组织中弱表达；D表示MTDH在脑胶质瘤组织中弱表达；E表示Six1在脑胶质瘤组织中高表达；F表示MTDH在脑胶质瘤组织中高表达
图1免疫组化染色检测Six1和MTDH在人脑胶质瘤中的表达(×400)

图2 不同Six1表达水平脑胶质瘤患者生存曲线比较

2.6影响脑胶质瘤患者预后Cox多因素分析 经多因素Cox比例风险回归模型分析得出：肿瘤低分化、Six1阳性、MTDH阳性表达均为影响脑胶质瘤患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

图3 不同MTDH表达水平脑胶质瘤患者生存曲线比较

表3 影响脑胶质瘤患者预后的单因素分析

表4 影响脑胶质瘤患者预后Cox多因素分析

3 讨 论

人脑胶质瘤是临床上常见的中枢神经系统疾病，有较高的致死率，预后较差。目前临床上对于人脑胶质瘤主要采取手术联合放疗及化疗等综合治疗方式，虽能够改善患者临床症状，但预后效果仍无法得到保障。但有研究发现，人脑胶质瘤中的蛋白表达能够反应出肿瘤严重程度[11]。既往研究发现，Six1在多种肿瘤中的表达水平升高，且与肿瘤的发展及预后有着重要关系[12]。廖粤军等[13]通过研究MTDH在肿瘤中的表达，并发现MTDH随着肿瘤逐渐严重其表达水平呈现高表达状态。说明MTDH在肿瘤的发生与发展中具有重要意义。本次研究运用免疫组织化学染色法检测150例人脑胶质瘤的表达以及不同病理特征以及预后的相关性。

结果显示，Six1、MTDH蛋白阳性表达率在人脑胶质瘤组织中明显升高，并与脑胶质瘤的分化程度显著相关(P<0.05)，且随着肿瘤分化程度逐渐严重，Six1、MTDH阳性表达率越高(P<0.05)，表明Six1、MTDH表达与肿瘤等级呈正相关，能够反应疾病的严重程度。本次研究运用Spearman等级相关分析法，结果显示脑胶质瘤患者中Six1、MTDH蛋白表达呈正相关(r=0.354，P<0.05)，由此可见，Six1、MTDH具有较强的相关性。在人脑胶质瘤中Six1、MTDH阳性表达的中位生存时间均缩短，并与肿瘤的分化程度密切相关。为了进一步证实，本次研究还运用了Cox比例风险回归模型，结果显示，肿瘤低分化、Six1、MTDH阳性表达均为影响脑胶质瘤患者预后的独立危险因素(P<0.05)，表示Six1、MTDH表达能够反应人脑胶质瘤的严重程度，可作为评估患者预后的有效指标。

Six家族主要是由Six1/Six2、Six3/Six6、Six4/Six5亚家族组成[14]。其中Six1作为同源盒基因成员之一，产物蛋白是由高度保守的同源异型结构域的N-末端以及Six结构域组成[15]，基因主要定位于人染色体14q23上，能够特异性的调节基因的表达，不仅能够影响组织细胞的发育，同时对细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等方面均有着重要的作用[16]。同时近来研究发现，Six蛋白在多种肿瘤中表达上调，能够诱导肿瘤细胞增殖、侵蚀以及转移，对于肿瘤的发生、发展有着重要的意义[17]。MTDH属于星型细胞上调基因-1的表达产物，是一种极其保守的蛋白，其蛋白基因主要定位于8q22上，并具有多个转录子，其跨膜区在432至451氨基酸以及561至580氨基酸之间，存在与核定位信号相关的赖氨酸[18-19]。并发现MTDH与多种肿瘤的发展、增殖、侵蚀、转移相关[20]。但本组研究选取样本量较少和研究时间过短，更多研究结果，需进一步深入研究。

4 结 论

Six1蛋白与MTDH蛋白在脑胶质瘤患者组织中的表达水平升高，其表达水平随着脑胶质瘤恶性程度的升高而升高，Six1蛋白表达阳性或MTDH蛋白表达阳性患者预后较差，生存时间明显缩短。Six1蛋白与MTDH蛋白可作为判断脑胶质瘤患者预后的生物标志物。