非健康乌苏里蝮雄性生殖系统组织学结构初探

姚晨昊 路生鑫 陆宇燕* 李丕鹏 薛百强 周正彦，3

(1.沈阳师范大学两栖爬行动物研究所，沈阳，110034；2.沈阳宏泰蛇类养殖有限公司，沈阳，110168；3.沈阳师范大学实验中心，沈阳，110034)

乌苏里蝮(Gloydiusussuriensis)隶属蝰科(Viperidae)，亚洲蝮属，在东北又称白眉蝮，俗称七寸子、土球子、草上飞，广泛分布于我国东北黑龙江、吉林、辽宁三省，在俄罗斯远东地区以及朝鲜均有分布[1]。由于乌苏里蝮蛇毒成分特殊的药用价值[2-4]，近年来野外种群数量呈急剧下降趋势。国内很多养殖单位都在寻求人工养殖乌苏里蝮的方法，希望实现养殖条件下的成功繁育，以达到最大程度地补充商业需求，并维持野外种群的稳定。但目前乌苏里蝮的生物学资料极少，仅见对乌苏里蝮蛇毒成分的研究[2-7]和无冬眠与冬眠条件下乌苏里蝮生长发育规律以及捕食行为与排毒量的研究[8-9]，而对乌苏里蝮生殖生物学方面的报道极少[10-11]，并未见到乌苏里蝮疾病方面的相关报道。本研究在对乌苏里蝮生殖系统进行组织学观察时，发现了2条消化道结构异常的个体，而它们的精巢在解剖学特征上与健康蛇之间也表现出明显的差异。虽然目前没有查询到关于消化道疾病与生殖系统结构和功能之间关系的研究报道，但本文试图探究两者的内在关联，为乌苏里蝮的生物学研究积累科学资料，也为人工养殖乌苏里蝮的疾病预防和治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用乌苏里蝮来自牡丹江地区，在养殖场饲养1年左右，于2018年5月随机选取外观正常的成年雄蛇，共计4条。经解剖后确认健康蛇2条，患病蛇2条。

1.2 方法

将实验用蛇置于放有适量乙醚的干燥器中，当触及蛇体没有明显应激反应时取出，利用Mettler ToledoQ/OAFA02—2009电子天平(精度 0.01 g)进行称重，利用米尺测量蛇体长和体全长。用“U”铁丝将头部固定于解剖板上，用透明胶带将吻部封闭，并固定。经腔上鳞前缘纵剖腹部至下颌处，检查各个器官位置、形态和色泽等，并拍照。剥离出双侧精巢和输精管，利用Mettler ToledoQ/OAFA02—2009电子天平(精度 0.01 g)分别进行称重，利用哈尔滨量具厂GB/T 14899—94 数显游标卡尺进行长度测量。取左侧精巢和输精管前半段制成悬液，进行精子形态学测量。其余部分置于DW—50 W255冰柜中冰冻待用。右侧精巢和输精管置于10%的中性福尔马林溶液中固定至少24 h后，取右侧精巢中段，输精管前段1/3长度流水冲洗过夜，常规石蜡切片，厚7 μm，H.E 染色。利用Olympus BX5显微镜和Olympus DP71摄像头观察拍照，Image-Pro Plus 测量。实验数据采用13.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，相关数据以平均值±标准差表示，设置P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

1.3 相关计算方法

躯体肥满度(g/cm3)=躯体重(除去内脏后的胴体重，g)/体长3(cm3)[12]

精巢系数=[精巢重量(左右两侧精巢重量之和，g)/躯干重(g)]× 100%[13]

精巢长与体长的比值=精巢长(左右两侧精巢长之和，cm)/体长(cm)

精子团面积与输精管管腔面积的比值=精子团面积(cm2)/输精管管腔面积(cm2)

2 结果

2.1 大体解剖学

2.1.1 解剖观察

正常乌苏里蝮纵剖后(图1 A)，可见2个精巢分别位于小肠的左右两侧，长水滴状，乳黄色，并可见有较为密集的毛细血管的分布，右侧精巢明显高于左侧。而在精巢分布的相应区段，可见呈新鲜肉红色的肠管(小肠部位)。肠管饱满，呈略微弯曲状盘曲在体腔的后半部分。

具肿块蛇解剖后脏器整体颜色缺少血色，精巢颜色与肠管相近，呈淡土黄色，少有毛细血管的分布。由于在右侧精巢的前方有一个棒状肿块(图1 B，黄色箭头段处为肿块的原始位置)的存在，其长度明显变小(表1)。棒状肿块，有膜包被，与消化道可轻松剥离，长度约60 mm，肉眼可见膜内紧密排列着大小不均、形态各异的椭圆粒状结构。此蛇的其他各器官未见实质性病变。

图1 5月乌苏里蝮健康蛇和患病蛇的解剖结果及光学显微镜下精子结构Fig.1 Anatomical results of healthy and diseased snakes，and sperm structure under optical microscope of Gloydius ussuriensis in May 注：A.健康蛇，B.具肿块蛇、双箭头示将异物从图示位置平移出体腔外，C.小肠肿胀蛇，D.精子；1.胃，2.精巢，3.小肠，4.脂肪体，5.小肠肿胀部位；a.顶体，b.头长，c.尾中段，d.尾主段和尾末端，e.尾 Note：A.Healthy Gloydius ussuriensis，B.With lump snake，the double arrow head shows the foreign matter out of the body cavity from the pictorial position，C.Small intestine with swollen snake，D.Sperm；1.Stomach，2.Testis，3.Small intestine，4.Fat body，5.Swelling site of small intestine；a.Acrosome，b.Head length，c.Midpiece of tail，d.Principal and end pieces of tail，e.Tail

表1 乌苏里蝮雄蛇5月一般形态学测量指标

Tab.1 General morphological parameters of male Gloydius ussuriensis in May

小肠肿胀蛇解剖后可见体腔中脏器颜色较为暗沉，两个精巢上少见有毛细血管的分布。而在两精巢之间的小肠前端部分呈肿胀状态(图1 C)，其长度约为40 mm左右。此部分小肠呈乳白色，肠管直径明显大于后方的小肠，用镊子触碰此部位略硬。而此蛇其他各器官未见实质性病变。

2.1.2 相关形态学测量

表1显示，在躯体肥满度、精巢长/体长和精巢系数3个指标的数值上，具肿块蛇和健康蛇均较为接近，而小肠肿胀蛇这3项指标分别仅是健康蛇的78.13%、60%和72.04%，小肠肿胀蛇是具肿块蛇的75.76%、75%和73.63%。即小肠肿胀蛇在这3项指标的数值上与健康蛇和具肿块蛇均出现了明显的差异。

2.1.3 精子形态

在观察由输精管中段制备而成的精子涂片时发现，健康蛇、具肿块蛇和小肠肿胀蛇的精子均可清晰分辨出精子基本结构(图1 D)。成熟精子可区分出3个结构成分，即头部、颈部和尾部。吉姆萨染色后，精子头部呈蓝色，尾部呈蓝紫色，两者之间为半透明的收缩区即精子的颈部。精子的头部整体呈长圆锥状，前1/4着色较浅的为顶体，其后着色深蓝色部分是精子核的部位，尾部可区分为略粗的主段和较细的末端2部分。表2显示，健康蛇、具肿块蛇和小肠肿胀蛇输精管内精子各部位测量数据上均无显著性差异。

表2 乌苏里蝮雄蛇输精管中精子形态学测量

Tab.2 Morphological measurements of sperm in the seminiferous duct of male Gloydius ussuriensis

2.2 组织学

2.2.1 精巢组织学观察

健康乌苏里蝮精巢切片中曲细精管饱满，大多呈圆形或者椭圆形，排列整齐，间隙均匀。曲细精管之间由结缔组织充填，即精巢中的间质区(图2 1)。曲细精管管壁结构可清晰分辨出基膜(basal lamina，由纤维成分和类肌细胞构成)和生精上皮(spermatogenic epithelium)。生精上皮由支持细胞(sertoli cells，Sert)、精原细胞(spermatogonia，SPG)、初级精母细胞(primary spermatocyte，PS)、次级精母细胞(secondary spermatocyte，SS)、精子细胞(spermatids，SPT)和精子 (spermatozoa，SPZ)构成(图2 4)。曲细精管的生精状态在所观察的曲细精管中存在着明显的差异，有的生精上皮排列整齐，可见大量各级精母细胞(图2 4b)，并可观察到大量分裂相和具有杆状核的变态中的精子细胞；有的已经基本完成了精子演化过程，生精上皮的排列显得有些许凌乱，并在近腔面可见大量完成变态的精子。各级生精细胞和支持细胞胞核均为深染，胞质均匀，细胞界限依稀可辨。间质区可见较多的椭圆形或者长椭圆形的间质细胞，一般3—5成群。在曲细精管管腔中，可见疏密不同的丝状残留物和少量精子。

具肿块乌苏里蝮精巢中曲细精管结构不规则，均呈明显的塌陷状，可见少量疑似管壁破裂处(图2 2a)。生精上皮排列松散，成束排列的现象基本消失，出现了明显的分层和剥落现象(图2 5)。生精上皮的个别区域虽然仍可见有精母细胞的分裂相，但发现细胞胞质淡染，且有明显的空泡状，疑似水样变性或脂肪变性特征，故生精上皮整体染色较健康蛇的浅(图2 5e)。管腔中丝状物较稀少，极少见精子游离其中。间质区明显增大，其中结缔组织也极其松散。

图2 乌苏里蝮健康蛇和患病蛇的精巢及输精管结构Fig.2 The schematic diagram of the testis and vas deferens of healthy and diseased of the Gloydius ussuriensis 注：1、4.健康乌苏里蝮5月的曲细精管及生精上皮，2、4.具肿块乌苏里蝮的曲细精管及生精上皮，3、6.小肠肿胀乌苏里蝮的曲细精管及生精上皮，7、10.健康乌苏里蝮5月的输精管及输精管壁，8、11.具肿块乌苏里蝮的输精管及输精管壁，9、12.小肠肿胀乌苏里蝮的输精管及输精管壁；a.管壁破裂，b.束状排列的生精细胞，c.空泡状细胞，d.管腔中丝状物，e.细胞破裂，f.“拉丝”状结构，g.黏膜层与肌层破裂，h.黏膜细胞缺损，i.上皮细胞呈假复层结构；L.腔，Leyd.间质细胞，SPG.精原细胞，SPC.精母细胞，SPT.精子细胞，Sert.支持细胞，SPZ.精子，Ec.脱落细胞 Notes：1 and 4.Seminiferous tubules and spermatogenic epithelium of Gloydius ussuriensis in May，2 and 4.Seminiferous tubules and seminiferous epithelium of Gloydius ussuriensis s with lump，3 and 6.The seminiferous tubules and seminiferous epithelium of Gloydius ussuriensis with swelling of small intestine，7 and 10.Vas deferens and vas deferens wall in May of healthy Gloydius ussuriensis，8 and 11.The vas deferens and the wall of the vas deferens of Gloydius ussuriensis with lump，9 and 12.The vas deferens and the wall of the vas deferens in small intestine swelling of Gloydius ussuriensis；a.Rupture of pipe wall，b.Fasciculate spermatogenic cells，c.Vacuolar cell，d.A filamentous substance in a lumen，e.Cell rupture，f.“drawing” structure，g.Rupture of mucous layer and muscle layer，h.Mucosal cell defect，i.Epithelial cells with pseudo-lamellar structure；L.Lumen，leyd.Leydig cells，SPG.Spermatogonia，SPC.Spermatocytes，SPT.Spermatids，Sert.Sertoli cells，SPZ.Spermatozoa，Ec.Exfoliative cell

表3 乌苏里蝮精巢和输精管形态学测量

Tab.3 Morphological measurements of the testis and vas deferens of male Gloydius ussuriensis

注：*表示呈显著性差异(P<0.05)；**表示呈极显著性差异(P<0.01)

Note：*Indicates correlations between date(P<0.05).**Indicates extermely significant correlations between date(P<0.01)

小肠肿胀乌苏里蝮精巢中曲细精管排列出现聚集现象，一般为6—9个曲细精管聚集在一起，其间间质成分较少。精巢的生精上皮未见束状排列以及有序的生精过程，仅可见极少的分裂相，其结构更加松散和杂乱(图2 3)。有更多生精上皮细胞出现了水样变性或脂肪样变性，使得生精上皮整体染色较健康蛇和具肿块蛇的更浅(图2 6e)。管腔较小，其中丝状物稀疏，还可观察到圆形核的游离细胞和极少量的具杆状核的变态精子细胞(图2 3d)。

表3显示，曲细精管直径依大小顺序为：具肿块蛇>健康蛇>小肠肿胀蛇，具肿块蛇和小肠肿胀蛇的曲细精管直径与健康蛇之间分别呈显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。生精上皮厚度，具肿块蛇与健康蛇较接近，而小肠肿胀蛇与健康蛇之间呈极显著性差异(P<0.01)。

2.2.2 输精管

健康乌苏里蝮输精管壁由内向外依次为黏膜层、肌层和浆膜(图2 10)。黏膜层为矮柱状上皮细胞，细胞排列整齐，胞核圆形或椭圆形，深染，位于细胞基底部。胞质均匀，游离缘可见微弱的微绒毛。在黏膜层细胞中，可见个别细胞有脱离基膜的趋势，细胞结构完整。同时，在管腔精子中也观察到圆形非精子细胞的存在，故将这些细胞暂称为“脱落细胞”，大多输精管横切面中均可见3个左右脱落细胞。肌层由4—6层平滑肌构成，细胞饱满，胞核梭形，深染；浆膜层为结缔组织，含有丰富血管和神经。输精管管腔内含有大量精子聚合在一起形成的精子团(图2 7)，精子团占据了输精管的绝大部分空间，其与管壁分离之处均可见由稀薄的分泌物形成的“拉丝”状结构(图2 10f)。精子团结构密集，其所占面积是管腔总面积的79%。

具肿块乌苏里蝮输精管管壁黏膜上皮细胞由1—2层立方上皮细胞构成，细胞排列出现松散迹象，细胞中可见大量的空泡状结构，即水样变性或脂肪样变性。可见多处黏膜细胞出现破损现象(图2 11h)，且细胞间的连接有明显的损伤，使胞间出现了较大的空隙(图2 8g)。肌层有增厚的趋势，大多数区域可分辨出9层平滑肌细胞。另外，构成浆膜的结缔组织明显较健康蛇增厚，但结构较稀疏。输精管中精子团与管壁完全分离，“拉丝”状结构消失；精子团中脱落细胞数增多，平均达到8个。精子团面积明显缩小，仅占管腔总面积的70%。

小肠肿胀乌苏里蝮输精管管壁黏膜层明显增厚，黏膜上皮细胞形似假复层上皮结构，可分辨出2—4层细胞核(图2 12i)。胞核大小不一，圆形或椭圆形；胞质呈絮状，很多区域均呈空腔状，个别区域有明显的缺损现象。肌层厚度小于健康蛇和具肿块蛇，细胞排列紧密，由2—3层平滑肌细胞构成。浆膜完整。精子团进一步缩小，其密度也有明显降低。但其中的脱落细胞数明显增加，均数达到了15个。精子团面积仅占管腔总面积的49%。

表3显示，具肿块蛇输精管黏膜上皮厚度虽略大于健康蛇，但两者间无显著性差异，而小肠肿胀蛇的输精管黏膜上皮厚度几乎是健康蛇的2倍，它们之间呈极显著性差异(P<0.01)。2条患病蛇输精管横切面积以及精子团面积均小于健康蛇，并与健康蛇之间均具有显著性差异，患病蛇的输精管面积与精子团面积的比值均小于健康蛇，且与健康蛇之间呈极显著性差异(P<0.01)。

2.2.3 消化道旁肿块

对消化道旁肿块的组织学观察可知，肿块有横切面完整的被膜，并有向内突起的嵴(图3 1a)，被膜中有丰富的毛细血管分布，且在血管周围可见较多的嗜酸性颗粒细胞的分布(图3 2c)；被膜内物质可分为内外2层结构，外层嗜酸性，呈淡粉红色，质地均匀呈蜡样，其间有不规则的裂隙部分(图3 1d)；内层弱嗜碱性，均匀度略差，有空泡样结果存在(图3 1b)。

2.2.4 小肠肿胀

正常乌苏里蝮小肠绒毛主要由黏膜层和少量的黏膜下层构成，黏膜层的固有层中未见腺体分布(图3 3、4)。但在小肠肿胀蛇的小肠黏膜层中，可见发育程度极好的腺体，并可清晰分辨腺体近肠腔处为黏液腺细胞构成(图3 5、6e)，其下方腺细胞呈典型的分泌蛋白质(酶)的染色特征，类似于胃底腺的染色特征。

3 讨论

作为真正适应陆地生活的爬行类，影响其繁殖活动的环境因子中最主要的是温度，其次是湿度[14-15]。因此，在温带分布的爬行动物生殖均有着明显的季节性[16-17]。Girons[18]认为雄性爬行类生殖周期可划分为交配后型、交配前型、混合型和连续型等4种类型，其中交配后型适用于分布在温带地区的爬行类。它们的精子发生于温暖的季节，成熟的精子储存于附睾及输精管内，交配期一般在春天。李建立等[10]研究显示，东北地区的乌苏里蝮交配盛期为6—7月。本研究发现圈养条件下，5月健康的乌苏里蝮曲细精管的组织学结构特征正处于新一轮生精过程的起始，而大量的成熟精子则集中于输精管中，这种现象与交配后型生殖周期的特点相符。即可以确定，东北地区分布的乌苏里蝮的生殖周期应该属于交配后型。那么被观察的乌苏里蝮输精管中的精子就应该是上一年度生精过程产生的，在越冬期储存于输精管中，等待进行交配[19-23]。这种生殖周期的特性也就解释了本研究所观察到的健康蛇、具肿块蛇和小肠肿胀蛇输精管中精子形态和各部分测量数值上没有明显的差异现象。但由于已经观察到2条患病蛇输精管结构有了明显的病变特征，由此可以推测输精管的功能在一定程度上也将有所变化，而在这样变化了微环境的输精管中储存的精子是否能确保具有良好的精子活力，有待于进一步观察研究。

图3 乌苏里蝮健康蛇和患病蛇的消化道结构Fig.3 The schematic diagram of digestive tract structure of healthy and diseased Gloydius ussuriensis 注：1.肿块整体横切面，2.被膜，3、4.正常乌苏里蝮小肠结构，5、6.小肠肿胀区段小肠结构；a.嵴，b.内层弱嗜碱性，c.嗜酸性颗粒细胞，d.外层嗜酸性，e.黏液腺细胞 Note：1.The cross section of the lump，2.Capsule，3 and 4.Normal intestinal structure of Gloydius ussuriensis，5 and 6.Small intestine structure in swelling section of small intestine；a.Crest，b.The inner layer is weak basophilic，c.Eosinophils，d.Outer layer eosinophil，e.Mucinous gland cells

动物脏器重量、形态和色泽是衡量动物健康与否的重要指标，也是动物学实验中常用的重要基础数据。依据这些指标可以大体确定内脏器官病变的性质和程度[24]。另外，在对两栖类生殖器官的研究中发现精巢重量可以作为检测精巢功能的一个适当指数，精巢重量的季节性变化与精子发生的进程一致[8]。在本研究中也显示了2条患病蛇精巢在形态和色泽与健康蛇有明显的差异，在精巢系数和精巢长与体长的比值上与健康蛇有显著差别，这就提示了患病蛇精巢出现了较严重的病变可能。从组织学结构观察进一步证实了患病蛇曲细精管和输精管的结构以及精子演化进程等方面患病蛇与健康蛇之间具有显著差异，这将严重影响下一年度精子的演化和发育，进而导致繁殖行为的失败。

在畜禽养殖中，将动物摄入的营养成分划分为转化营养、免疫营养、生殖营养、生态营养和水营养等5个方面，其中，生殖营养是指能调理畜禽内分泌机能，完善生殖器官结构与功能的功能性成分[25]。目前，虽然蛇类疾病已有较广泛的研究[26-31]，但针对生殖系统疾病以及生殖系统与其他系统疾病的关系研究均未见报道。本研究所观察的2条患病蛇，除消化道有相应的病变外，其他器官均未见明显的形态学上的变化。因此，我们推测消化系统疾病导致了动物对食物的消化和吸收功能减弱，进而机体投入繁育的营养和能量出现了调整，致使生殖腺结构的退行性变化。但这样的推测还需要积累更多的资料，不过本研究的结果，也给蛇类养殖业提供了一个必须重视的问题，即需要时常观察蛇类的进食、活动程度及日常行为变化，便于及时对养殖蛇进行筛选，确保种蛇的健康并能进行正常繁育，确保商品蛇有较高的转化率，避免养殖过程中不必要的人力和财力浪费。由于对蛇类健康指标研究的欠缺，还需要努力积累相关各项数据。

淀粉样变性是一组由于各种原因引起的蛋白质错误折叠形成了含有β折叠片结构的淀粉样物质浸润、沉积在脏器细胞间导致的组织损伤或进行性多器官功能障碍的疾病。可以利用常规组织学染色中的HE染色方法做出初步判断[32]。本研究中消化道旁肿块的HE染色切片中，可观察到肿块中间物质呈粉红色，不定型，蜡样和有特征性裂纹，这些均为淀粉样变性的典型诊断指标，但大多数的淀粉样变性均散布于组织间，少有呈息肉样病变或者结节样隆起[33]。而本研究中的肿块独立于消化道外，仅由浆膜与小肠连接在一起。因此，乌苏里蝮的消化道旁肿块是否属于特殊类型的淀粉样变性还需进一步研究。

对爬行类消化道研究显示，仅在十二指肠黏膜层中可见不甚发达的十二指肠腺，而小肠黏膜中均未见肠腺的分布[34-36]。但在人类医学研究十二指肠中，有一种来自胚胎期固有层肠腺延伸至黏膜下层而成特化的腺体(Brunne腺)，其腺泡细胞为浆-黏液细胞，分泌碱性黏液、碳酸氢盐等以保护十二指肠黏膜免受胃液和胰液消化侵蚀。而且，在高胃酸分泌情况下，腺体会出现保护性的增生，偶尔在胃窦和空肠前端可见，故又称Brunne腺错构瘤[37-38]。本研究中，乌苏里蝮小肠肿胀区段黏膜层出现的极其发达的腺体，即由黏液腺细胞和浆液腺细胞构成。那么，是否与Brunne腺错构瘤有着类似的形成原因，仍需要深入研究。

由于蛇类养殖起步不久，对其生长过程中各方面营养需求和疾病防治远不及畜禽研究的全面和深入，还需要不断探索，揭示蛇类养殖和疾病防御的一系列问题。