类风湿关节炎患者血清外泌体miR-223、miR-155表达水平及临床意义

孙 广 候贻莉 吴 辉 王 萍

(安顺市人民医院，安顺561000)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜关节受累为主要临床表现的系统疾病，多发生于双手关节、膝关节及足关节等[1]。流行病学研究表明，中国RA疾病发生率为0.32%～0.40%，随着人口老龄化的增加，RA患病人数逐年增加，是导致残疾的主要关节疾病之一[2]。目前临床主要以延缓疾病进展，减轻关节炎症为主，尚无根治RA疾病的治疗策略。因此，尽早诊断出RA疾病有利于及时干预，减缓疾病发展，减少致残情况的发生。研究表明，免疫细胞活性失衡、炎症反应、自身抗体生成等在RA疾病发生中具有重要作用[3]。既往研究表明，多种微小RNAs(Micro RNAs，miRNAs)对以上生物过程具有一定调控作用[4]。另外研究表明，外泌体携带的miRNA在一定程度上可反映其产生细胞的病理状态，如在胰腺炎大鼠模型中，来自胰腺泡细胞的外泌体中包含大量调节炎症反应的miRNAs，参与激活肺泡巨噬细胞，引起炎症反应[5]。因此，本研究通过检测RA患者血清外泌体中miR-223、miR-155表达情况，并分析二者与RA患者临床特征和炎症因子水平的相关性，旨在揭示血清外泌体miR-223、miR-155表达在RA疾病发生发展中作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入2015年4月～2017年8月在本院初诊的RA患者77例为研究对象，其中男23例，女54例，年龄26～80岁，平均(50.23±9.85)岁，所有患者均进行28关节疾病活动性评分(Disease activity score in 28 joints，DAS28)，根据2010年欧洲抗风湿联盟和美国风湿协会修订的RA诊断标准[6]进行诊断，纳入标准：①均符合上述RA诊断标准；②年龄26～80岁；③入院治疗前未进行抗风湿药物治疗；④知悉本研究内容并自愿加入；⑤依从性良好。排除标准：①排除合并其他自身免疫性疾病患者；②排除患有感染性疾病患者；③排除其他可能引起炎症反应疾病患者；④排除患有高血压、糖尿病、肝肾疾病等患者。另选取同期在本院进行体检的健康者75例为对照，其中男19例，女56例，年龄28～80岁，平均(49.78±9.35)岁。两组受试者年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1资料采集 收集受试者年龄、性别一般资料和DAS28评分、抗环瓜氨酸多肤抗体(anti-cyclic peptide containing citrulline，anti-CCP)抗体、C反应蛋白(Creaction protein，CRP)、红细胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)、类风湿因子(Rheumatoid factor，RF)等实验室检查指标。

1.2.2标本采集 分别于体检当日和入院12 h内采集体检者和RA患者肘静脉血(6 ml/人)，置于抗凝真空管中，取2 ml离心后保存上清，待测；剩余4 ml 采用外泌体试剂盒(德国QIAGEN公司)提取收集血清外泌体。

1.2.3检测方法 采用ELX800自动酶标仪(美国BioTech公司)通过人肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α酶联免疫吸附试剂盒(货号：ab181421，美国ABCam公司)、人白介素(Interleu-kin-6，IL-6)酶联免疫吸附试剂盒(货号：ab46027，美国ABCam公司)、人IL-17酶联免疫吸附试剂盒(货号：ab119535，美国ABCam公司)、人IL-1β酶联免疫吸附试剂盒(货号：ab197447，美国ABCam公司)测定各受试者血清中TNF-α、IL-6、IL-17和IL-1β水平；采用外泌体RNA提取试剂盒(美国Life公司)提取血清外泌体总RNA，试剂盒富集miRNAs，以U6作为内参，采用实时荧光定量(real-time fluorescence quantitative，qRT)-PCR技术检测并分析血清外泌体中miR-223、miR-155表达。

2 结果

2.1两组受试者临床特征比较 RA组患者的性别、年龄与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；RA组患者的DAS28评分、抗CCP抗体水平、血清CRP水平、红细胞沉降率、类风湿因子水平，见表1。

2.2血清外泌体miR-223、miR-155水平的比较 RA组患者血清外泌体miR-223、miR-155相对表达量均明显高于对照组健康者(P<0.05)，见表2。

2.3血清外泌体miR-223、miR-155水平对RA疾病的诊断价值 ROC结果显示，miR-223对RA疾病诊断的AUC为0.842(95%CI：0.754～0.931，P<0.05)，miR-223/U6≥3.53诊断RA疾病的敏感度为82.51%，特异度为78.56%，详见图1A；miR-155对RA疾病诊断的AUC为0.764(95%CI： 0.635～0.857，P<0.05)，miR-155/U6≥4.15诊断RA疾病的敏感度为61.83%，特异度为76.58%，详见图1B。

表1 两组受试者临床特征比较

Tab.1 Comparison of clinical characteristics between two groups of subjects

CharacteristicsRA groupControl groupt/χ2PGender(Male/Female)23/5419/560.3910.532Age(Year)50.23±9.8549.78±9.350.2890.773DAS28(Point)5.97±1.12046.1580.000Anti-CCP antibody(U/ml)213.59±42.57043.4480.000CRP(mg/L)16.37±3.450.34±0.0540.2310.000ESR(mm/h)36.75±9.7811.81±2.1421.5850.000RF(U/ml)437.27±73.56051.4760.000

表2 血清外泌体miR-223、miR-155表达的比较

Tab.2 Comparison of serum exosomes miR-223 and miR-155 expression

GroupsnmiR-223/U6miR-155/U6Control751.01±0.161.07±0.23RA773.46±0.734.08±0.79t-28.40631.711P-0.0000.000

图1 血清外泌体miR-223、miR-155水平诊断RA疾病的价值Fig.1 Value of serum exosomes miR-223 and miR-155 in diagnosis of RA disease

表3 血清炎症因子水平的比较

Tab.3 Comparison of serum inflammatory factors levels

GroupsnTNF-α(pg/L)IL-6(ng/L)IL-17(ng/L)IL-1β(ng/L)Control756.87±1.371.46±0.2914.75±2.761.53±0.31RA7716.23±3.2513.48±2.5838.64±7.3920.18±3.94t-23.24240.62326.53341.409P-0.0000.0000.0000.000

表4 血清外泌体miR-223、miR-155水平与RA患者临床特征的相关性分析

Tab.4 Correlation between serum exosome miR-223 and miR-155 levels and clinical features of RA patients

FactorsmiR-223rPmiR-155rPDAS280.5090.0000.5150.000Anti-CCP antibody0.5930.0000.5940.000CRP0.6020.0000.4970.000ESR0.6150.0000.6030.000RF0.5760.0000.5430.000

2.4两组受试者血清炎症因子水平的比较 检测结果显示，RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平均明显高于对照组健康者(P<0.05)，见表3。

2.5血清外泌体miR-223、miR-155水平与RA患者临床特征的相关性 Pearson检验显示，血清外泌体miR-223、miR-155水平与RA患者DAS28评分、血清抗CCP抗体、CRP、ESR、RF水平正相关(P<0.05)，见表4。

2.6血清外泌体miR-223、miR-155水平与RA患者血清炎症因子水平的相关性 Pearson检验显示，血清外泌体miR-223、miR-155水平均与RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平正相关(P<0.05)。

表5 血清外泌体miR-223、miR-155水平与RA患者炎症因子水平的相关性分析

Tab.5 Correlation analysis between serum exosome miR-223 and miR-155 levels and inflammatory factor levels in RA patients

FactorsmiR-223rPmiR-155rPTNF-α0.5090.0000.5980.000IL-60.5860.0000.6110.000IL-170.6210.0000.6710.000IL-1β0.5540.0000.5840.000

3 讨论

RA早期主要表现为滑膜炎，是关节病变的基础，进一步发展可导致患者软骨或骨组织损伤，甚至造成关节功能丧失，导致残疾，严重影响患者身体健康和生活质量。RA疾病早期表现为细胞浸润性和渗出性，滑膜组织间质出现炎症细胞浸润，炎症因子水平增加[7]。RA患者以30岁以上女性为主，涉及各个年龄段，随着我国人口老龄化水平增加，RA发病率随之逐年增加[8]。RA疾病发生时，患者关节已经出现一定程度损伤，是导致残疾的关节疾病之一，但其发病机制尚不明确。在疾病早期，采用非甾类抗炎药或糖皮质激素等抗风湿类药物处理可延缓疾病进展，改善患者症状，因此探究RA疾病发生机制，寻找合适生物指标，对RA疾病早期诊断和尽早治疗具有重要意义。

外泌体是一类含有核酸、脂类、蛋白质等物质，由多种细胞产生，分泌进入循环系统的膜性囊泡结构，其中包含有miRNA、长链非编码RNA等核酸类物质，具有在细胞间传递信号的作用[9]。miRNAs可与目标基因mRNA 3′非编码区进行特异结合，启动目标基因mRNA降解或抑制目标基因转录翻译，进而调控免疫反应和炎症反应等生物学过程。随着研究的深入，学者们发现miRNA参与自身免疫性疾病、呼吸系统疾病、肿瘤等多种疾病的发生[10]。另外，被包裹在外泌体中的miRNAs可有效避免血清中RNA酶降解，可被完整传递给受体细胞，参与调解生理过程[11]。Gao等[12]研究发现，来源自树突状细胞的外泌体可作用于受体细胞膜TNF-α，激活NF-κB通路，增加动脉血管内皮的炎症程度，加重动脉粥样硬化程度。近期研究表明，外泌体与RA疾病发病过程相关，通过将核酸等生物分子从供体细胞转移至受体细胞，参与调控受体细胞内信号通路并影响其功能[13]。基于以上研究结果，推测血清外泌体中miRNA表达可能作为潜在标志物用于RA疾病诊断。然而，目前关于RA患者血清外泌体miRNA表达模式的研究相对较少。

miR-223是一类哺乳动物常见的miRNA之一，存在于多种细胞、组织中，参与炎症反应等过程。Li等[14]研究发现，miR-223在RA患者血清中表达上调，参与破骨形成过程，动物实验表明，抑制miR-223表达可有效降低关节炎小鼠的关节炎评分、组织学评分及骨组织侵蚀，表明抑制miR-223活性可能作为治疗RA的策略。Shibuya等[15]发现，miR-223在RA患者滑膜组织中高表达，细胞实验表明，过表达miR-223可显著促进破骨细胞生成，破骨细胞增多是RA疾病发生的原因之一，提示miR-223可能作为治疗RA潜在靶点。以上研究表明，miR-223在RA患者血清及滑膜组织中均表达上调，参与RA疾病发生，但是关于RA患者血清外泌体中研究较少。本研究发现，RA患者血清外泌体中miR-223水平显著高于对照者，与Filková等[16]在RA患者血清中发现一致，表明miR-223在RA患者血清外泌体及血清中均呈高表达，可能参与RA疾病发生。ROC分析发现，血清外泌体miR-223对RA疾病诊断的AUC为0.842，表明检测血清外泌体miR-223水平可有效区分RA患者和健康者。另外，Elmesmari等[17]研究发现，miR-155在RA患者外周血、单核细胞中表达均显著高于对照组，可通过调节趋化因子和促炎症趋化因子受体表达促进炎症细胞聚集在关节滑膜，引发疾病。Alivernini等[18]发现，miR-155在RA患者外周血B细胞中高表达，可促进滑膜组织中IL-21等炎症因子表达，与滑膜组织炎症严重程度有关，表明miR-155在RA疾病中是激活B细胞的重要调控因子。本研究发现，RA患者血清外泌体miR-155水平显著高于对照者，与Rajasekhar等[19]在RA患者单核细胞和滑膜液中发现一致，表明血清外泌体miR-155表达上调可能参与RA疾病发生。ROC分析发现，血清外泌体miR-155对RA疾病诊断的AUC为0.764，表明检测血清外泌体miR-155水平可有效区分RA患者和健康者。

进一步分析发现，血清外泌体miR-223、miR-155水平与RA患者DAS28评分、血清抗CCP抗体、CRP、ESR、RF水平正相关，提示血清外泌体miR-223、miR-155与RA疾病进展有关。RA疾病是一种自身免疫性疾病，早期主要表现为病理性滑膜炎，研究发现，RA患者的滑膜组织中聚集有大量巨噬细胞等，产生并分泌大量TNF-α、IL-6等炎症因子进入循环系统，在RA疾病发生发展中具有重要作用[20]。与前人研究一致，本研究所纳入RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平亦明显高于对照者。进一步研究提示，血清外泌体miR-223、miR-155水平与RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平正相关，提示血清外泌体miR-223、miR-155可能通过调控TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β表达，参与RA疾病进展过程，这为进一步研究血清外泌体如何参与调节RA疾病发生和进展提供了一定思路。

综上所述，本研究发现miR-223、miR146a在RA患者血清外泌体中高表达，与患者疾病严重程度和血清炎症因子水平有关，提示血清外泌体miR-223、miR146a高表达参与RA疾病发生。