尿路感染大肠埃希菌ST131 克隆株的分子生物学特征分析

卢燕芳，李 彬，徐两蒲，兰芳俊，吴志辉，何清雯

大肠埃希菌是与人类疾病关系密切的肠道菌之一，可引起许多不同类型的肠外感染，如血流感染、脑膜炎和尿路感染等。而大肠埃希菌ST131克隆株是系统发育分型B2型中一类具有明确致病性的种群[1]，同时也是肠外致病性大肠埃希菌（ExPEC）感染的主要克隆群。该种群通常具有多种毒力因子，并与氟喹诺酮类和头孢菌素类抗菌药物耐药密切相关[1-2]。研究发现，大肠埃希菌ST131克隆株与肾盂肾炎高度相关，尤其是ST131的H30亚克隆株与持续性或复发性尿路感染密切相关[1-3]。本研究旨在分析尿路感染B2-ST131克隆株在本地区的流行情况和分子生物学特征，同时了解其与B2型非ST131克隆株的毒力和耐药情况，为今后进一步的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2014年8月－2015年8月福建医科大学附属协和医院临床分离的非重复中段尿培养大肠埃希菌357株。患者尿常规白细胞数≥5/HP且尿液培养菌落计数≥105CFU/mL，均诊断为尿路感染。所有菌株均使用VITEK系统鉴 定。

1.1.2 仪器和试剂 细菌鉴定仪为V.T.K 2-Compact全自动微生物检定仪（法国生物梅里埃公司），PCR扩增仪（美国Applied Biosystems公司），Universal HoodⅡ凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD公司），脉冲场凝胶电泳仪及GEL DOC2000凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD公司），PCR相关试剂（大连宝生物有限公司），DNA Maker、电泳用琼脂糖、Goodview核酸染料（上海铂尚生物技术有限公司），药敏纸片（英国OXOID公司）。

1.2 方法

1.2.1 系统发育分型 采用煮沸法提取357株菌株DNA模板，采用多重PCR扩增系统发育分型基因，包括ChuA、YjaA、TspE4.C2；PCR引物序列参照文献 [4]。

1.2.2 大肠埃希菌ST131克隆株筛查 采用PCR扩增针对大肠埃希菌ST131克隆株特异性gyrB、mdh基因和O血清型的分子分型基因（O1、O2、O4、O6、O7、O8、O15、O16、O18、O21、O22、 O25、O25b、O75、O83和O157），PCR反应体系和引物序列参照文献 [5-7]。根据Achtman方案，使用7个管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA）对所有非O25b、非O16和非B2群大肠埃希菌ST131克隆株采用多位点序列分型（MLST）验证是否为大肠埃希菌ST131克隆株。

1.2.3 药敏试验 采用美国临床和实验室标准化协会（CLSI）推荐的纸片扩散法药物敏感性试验[8]。酶抑制剂增强双纸片扩散法检测大肠埃希菌中的产超广谱β内酰胺酶（ESBL）菌株。根据CLSI（2017年版）[8]规定的折点判断敏感、中介和耐药。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.2.4 耐药基因的检测 采用PCR法扩增常见β内酰胺酶基因（blaCTX-M、blaTEM和blaSHV）。PCR反应体系和引物序列参照文献 [9-12]，阳性扩增产物送上海铂尚生物技术有限公司（Sanger测序法）测序，测序结果与GenBank序列进行BLAST比对分 析。

1.2.5 毒力基因的检测 采用多重PCR扩增15对毒力基因，PCR反应体系和引物序列参照文献 [13]。

1.2.6 统计分析 使用SPSS 19.0软件进行统计分析。使用χ2或Fisher确切概率法检验进行分析比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株的种系分型及大肠埃希菌ST131克隆株筛查

系统发育分型结果显示，357株大肠埃希菌中54株（15.1%）为A型，32株（9.0%）为B1型，162株（45.4%）为B2型，109株（30.5%）为D型。162株B2型大肠埃希菌中，MLST结果显示55株（55/162，34.0%）被鉴定为大肠埃希菌ST131克隆株，107株为B2型非大肠埃希菌ST131克隆株。55例尿路感染大肠埃希菌ST131克隆株患者中，门诊7例，住院48例。住院病例中复杂性尿路感染15例，非复杂性尿路感染33例。血清型的结果显示55株大肠埃希菌ST131克隆株属于两种类型，O25b-ST131（36株，65.5%）和O16-ST131（19株，34.5%）。162株B2型大肠埃希菌的临床信息见表1。

表1 尿标本162株B2型大肠埃希菌中ST131克隆株筛查 结果和相关信息Table.Details of the ST131 clone in the 162 strains of phylogenetic group B2 Escherichia coli isolated from urine samples

2.2 药敏试验结果

大肠埃希菌ST131和非ST131克隆株对15种常见抗菌药物的耐药率见表2，其中ST131克隆株对头孢唑林、头孢噻肟、头孢吡肟、甲氧苄啶-磺胺甲唑、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率显著高于非ST131克隆株。ST131克隆株的ESBL检出率65.5%高于非ST131克隆株的检出率35.5%（P＜0.05）。未检出对亚胺培南和厄他培南的耐药株；对磷霉素和呋喃妥因的耐药率≤3.6%，对阿米卡星的耐药率≤9.1%。

表2 尿标本大肠埃希菌ST131和非ST131克隆株对抗菌药物的耐药率和敏感率Table.Susceptibility of ST131 and non-ST131 clones E.coli to antimicrobial agents（%）

2.3 耐药基因扩增结果

55株大肠埃希菌ST131克隆株中共有48株（87.3%）携带β内酰胺酶基因。其中TEM-1型23株；CTX-M-1组12株（CTX-M-15型11株、CTXM-123型1株）；CTX-M-9组25株（CTX-M-14型25株）。1株同时携带CTX-M-15型和CTX-M-14型β内酰胺酶基因，11株携带CTX-M型和TEM-1型两种β内酰胺酶基因。未检出blaSHV、CTX-M-2组、CTX-M-8组和CTX-M-25组基因。见表3。

2.4 毒力基因分布

大肠埃希菌ST131克隆株中毒力基因的检出率高于20%的有12种，检出率最高的为fimH（98.2%）、fyuA（96.4%）和iutA（90.9%），而107株B2型非ST131克隆株中，毒力基因fimH（99.1%）、fyuA（91.6%）的流行率最高。毒力基因iutA、kpsMT K5和traT在ST131克隆株的流行率显著高于B2型非ST131克隆株（P＜0.05）。见表1。

表3 55株大肠埃希菌ST131克隆株中 β内酰胺酶基因的分布Table.Prevalence of β-lactamase gene in the 55 E.coli ST131 clones

3 讨论

尿路感染是临床中最常见的细菌感染性疾病之一。大肠埃希菌是引起尿路感染最主要的病原菌，75%单纯性尿路感染和65%复杂性尿路感染由大肠埃希菌所致[14]。大肠埃希菌不同系统发育群在耐药和致病性方面存在较大差异，文献报道，ExPEC不同系统发育群根据其致病能力从高到低分别为B2型、D型、A型和B1型[1]。本组资料显示，引起尿路感染的大肠埃希菌以B2型（45.4%）为主，D型（30.5%）次之，与国内外报道的相一致[1，15]。董敏等[15]对随机挑选尿路感染患者尿液分离的55株大肠埃希菌分析发现，B2型和D型分别占43.6%和41.8%，其携带的毒力基因种数最多且致病能力较强。本地区尿路感染患者中段尿分离的195株非B2型大肠埃希菌中D型的比例明显较高。本组资料显示，大肠埃希菌ST131克隆株在我院尿培养中有一定的流行，但流行率低（15.4%，55/357），远低于国外文献报道（27%～30%）[2-3]。推测其原因可能为地域或人口组成差异所致。本组资料显示O25b-ST131克隆株（65.5%）是临床尿路感染大肠埃希菌ST131的主要克隆株，O16-ST131克隆株占34.5%。这与国内Zhong等[16]2015年关于O16-ST131 和O25b-ST131克隆株研究报道相一致；但本组资料远高于国外同行的同类研究报道的结果[1，17-18]。目前，国内关于大肠埃希菌ST131克隆株的研究主要集中在O25b-ST131克隆株，而对O16-ST131克隆株的研究甚少，综合以前的研究，本组资料提示除O25b-ST131克隆株外，O16-ST131克隆株可能也是大肠埃希菌ST131克隆株的另一个重要类型，未来的研究应更多关注O16-ST131克隆群[16，19]。

本研究药敏结果显示，69.1% ST131克隆株对环丙沙星耐药，65.5%菌株产ESBL，产ESBL的ST131克隆株中，78.9% ST131克隆株对环丙沙星耐药。另外，ST131克隆株对头孢噻肟、头孢吡肟、甲氧苄啶-磺胺甲唑、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率显著高于非ST131克隆株，与文献报道的ST131克隆株对头孢菌素类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等抗菌药物的耐药率显著高于其他的ST菌株相符合[20]。大肠埃希菌ST131克隆株对临床常用抗菌药物高度耐药可能与临床药物使用方法和习惯有关，如氟喹诺酮类药物在临床上广泛应用于尿路感染的治 疗。

大肠埃希菌ST131克隆株是近年来细菌耐药研究领域非常热门的一类高耐药性的克隆株，该克隆株与头孢菌素类抗生素耐药密切相关[1，17]。本研究主要分析大肠埃希菌ST131克隆株对常见β内酰胺酶耐药基因的特征，结果显示本组大肠埃希菌ST131克隆株中主要以CTX-M型为主，其中blaCTX-M-14检出率（45.5%）最高，与国内外报道的大肠埃希菌ST131克隆株高blaCTX-M-14检出率（46%～48.4%）相一致[16，21]，提示blaCTX-M-14可能是该院大肠埃希菌ST131克隆株尿路感染患者对头孢菌素类药物耐药的主要原因。本研究中大肠埃希菌ST131克隆株对氟喹诺酮类药物耐药率高达69.1%。文献报道大肠埃希菌ST131克隆株对氟喹诺酮类药物耐药的主要原因是染色体介导的喹诺酮类耐药决定区基因（QRDR区）的染色体突变，特别是回旋酶gyrA1AB和拓扑异构酶Ⅳ的parC1aAB突变密切相关，大肠埃希菌ST131克隆株还与质粒介导的喹诺酮类耐药决定簇aac(6')-Ibcr的存在有关[22]。关于本组资料中氟喹诺酮类耐药菌株的特征有待进一步研 究。

本组资料显示，大肠埃希菌ST131克隆株中多种毒力基因的检出率高于非ST131克隆株的，其中iutA、kpsMT K5和traT均有显著差异。文献报道某些毒力基因的产物可能与大肠埃希菌ST131克隆株引起肾盂肾炎密切相关[1]。例如，iutA是编码细菌铁离子的转运系统，而kpsMT K5是Capsule synthesis 基因，文献报道由kpsMT K5编码的基因具有抗吞噬作用而增强大肠埃希菌ST131克隆株的发病机制[13]，本组资料显示，iutA和kpsMT K5的检出率为90.9%和58.2%。 综上所述，本组尿路感染的大肠埃希菌中存在强毒力和多重耐药的ST131克隆株，但其流行率低，主要包括O25b-ST131（65.5%）和O16-ST131（34.5%）两大类，提示O25b-ST131克隆株是本院尿路感染患者中ST131的主要流行型别。O16-ST131克隆株在毒力基因和耐药率方面显著有别于 O25b-ST131克隆株。故在防止O25b-ST131克隆株流行的同时也应该密切关注O16-ST131克隆株的发展趋势 。