精准医学背景下关于临床PCR扩增实验室存在的不足及反思

朱一帆 时超杰 李莎莎 何敖林

[摘要] 近年来精准医学的应用不断扩大，促进了PCR实验室的蓬勃发展，同时PCR实验室的检测准确度也影响着精准医疗的临床效果。PCR技术要求相对较高，稍有污染或操作不慎就容易造成结果偏差，所以检查实验室的疏漏和改进完善尤为重要。

[关键词] 精准医学;PCR实验室;检测准确度

[中图分类号] R19 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2019）09（b）-0023-03

近年来随着基因组测序技术的不断进步以及大数据科学的快速发展，精准医学—一种新型医学概念与医疗模式受到越来越多人的广泛关注。精准医疗是指利用患者的基因组信息，再与蛋白质组学等相關内环境信息相结合，最后制定出针对患者的一套包括精确诊断、用药及预后判断的治疗方案，可以实现治疗效益最大化和医疗资源配置最优化[1]。基因检测是精准医疗中最基础的一环，数据的背后都离不开PCR实验室的支持，因此PCR实验室出具的检测结果的准确性就显得尤为重要。现在PCR技术已经在传染病、肿瘤靶向、生殖遗传等领域被广泛应用，但因为该技术对待测核酸进行了多次、大量的扩增，所以即使极微量的污染也容易导致结果出现假阳性;其次PCR技术要求相对较高，实验过程繁复，中间环节如果出现遗漏疏忽，就有可能导致结果假阴性。为避免结果假阴性、假阳性以及出现误差，需要实验室人员及时发现实验室存在的不足并加以改正，这样才能为临床的进一步治疗提供最精准的数据。

1  该院临床PCR扩增实验室介绍

1.1  PCR实验室的基本概况

基于昆山地区肿瘤发生率逐年增高的现状，该PCR扩增实验室计划引进部分高端分子诊断项目，在此基础上开展药物基因组学检测、肿瘤分子靶向检测、生殖及遗传相关疾病的检测，以提高医院的分子诊断水平。该PCR实验室为昆山市第一人民医院临床实验研究中心下设的专业分子检测实验室，按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》建立，并通过江苏省临床检验中心认证，从事临床标本的基因扩增检测及相关实验工作。该PCR实验室主要通过实时荧光PCR技术检测基因位点做出临床诊断，由试剂贮存准备区、标本制备区、扩增区和产物检测区4个区组成，配备有副主任检验师1名，主管检验师1名，初级检验师2名。

1.2  现开展的临床项目简介

该PCR实验室现已开展及计划开展基因检测项目共7项，包括EGFR基因突变检测、MTHFR基因突变检测、ALDH2基因突变检测、CYP2C9基因突变检测、VKORC1基因突变检测、CYP2C19基因突变检测、药物性耳聋基因突变检测，主要为针对抗凝药物、肿瘤药物、叶酸、氨基糖苷类抗生素等药物的临床基因检测。目的在于检测药物对不同基因型人群是否有效、指导最适剂量、检验药物疗效、提示不良反应。

2  PCR实验室现存在的不足

2.1  PCR实验过程中易发生污染

产生污染主要有以下4个原因：①是PCR扩增产物的污染。这也是最常见的污染原因。PCR产物经反复多次的扩增，其复制量远远超过PCR的检测极限，所以即使是极微量的污染也足以造成实验结果假阳性。②试剂的污染。在试剂的配制过程中，接触了污染的容器、移液器、枪头、溶液等物导致试剂被污染。③待测样品被污染。放置样品的容器被污染或由于容器密封不严导致样品与外界接触被污染;其次在核酸提取过程中使用了被污染的移液器或枪头导致样品被污染;另外，某些样品中含有病毒，若弥散到空气中则有可能形成交叉污染。④气溶胶污染。若气溶胶中包含病毒等污染物扩散至空气中极有可能造成PCR产物污染。气溶胶是由空气与液体表面摩擦而产生的，开盖、晃动反应管及污染加样器的反复吸样都可形成气溶胶从而导致交叉污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48 000拷贝，因此，应尤其重视由气溶胶导致污染的问题[2]。PCR实验室只要出现了污染，之前的结果报告就变为无效而且也无法进行其他的实验操作。必须找出并彻底清除污染源，才能得到准确有效的实验结果。

2.2  实验室的质量控制存在缺陷

实验室的质量控制分为：室内质量控制和室间质量控制。室内质量控制是指实验室人员通过一定的方法和步骤，连续评价实验室工作的可靠程度，旨在监测和控制实验室常规工作的精密度，提高实验室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠及可否发出报告的一项工作[3]。室间质量控制是指客观比较实验室的测定结果与靶值的差异，由外部机构采取一定的方法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性[4-5]。该实验室存在以下几个缺点：①使用的质控品因为存放时间长久，存在使用时间超过保质期的问题，并且质控品来源单一导致不能及时发现质控品的质量问题;②质量控制的方法在SOP文件中表述不明确;③出现失控后反思问题分析原因不够全面、深入，多为混匀不充分、移液器存在误差、孵育时间不够等粗略的理由;④质控周期太长，如果实验过程中存在疏漏，不能及时发现并改正。

2.3  规范管理不到位

为了提高实验室的检测质量，避免实验室污染以及确保实验室的生物安全，规范有效的管理是实现这一切的根本措施。但有时会出现管理不到位甚至是疏忽的地方，比如随意出入实验室，甚至逆行;没有按照规范穿戴口罩、鞋套;试验期间缓冲间两侧门同时打开;实验完毕后忘记开紫外灯消毒等。这些不规范的行为为实验室的安全和污染埋下了隐患，从而影响检验结果的准确性。因此，有效的管理和实验室操作规程的规范执行尤为重要。

3  改进方法

3.1  防治污染的措施

3.1.1  实验室清洁  ①每个实验区都应配备专用的消毒试剂、工具。②如有样本或者试剂外溅的情况，应立即先用 10%次氯酸钠擦拭，再用清水擦洗，作好记录。③实验结束后用10%次氯酸钠对有可能被污染的区域如桌面、生物安全柜等进行消毒，并用移动消毒车对这些区域消毒（30 min）。④每日结束工作后用10%次氯酸钠擦拭移液器。⑤在实验结束离开实验室前，开启室内紫外灯定对实验室进行紫外照射消毒（60 min）。⑥工作服需要每周交于洗衣房清洗消毒，而且不可将不同区的工作服于同一天清洗。

3.1.2 规范操作  ①在操作中佩戴手套避免接触到与试管内面，使用带滤芯的吸头、离心管。②取样，加标本、反应液之前应先高速离心将管盖上液体沉于管底，以避免开盖时液体飞溅和产生气溶胶污染环境[6]。③若发生液体飞溅，首先隔离相关未被污染的物品，其次用吸水纸将液体吸干，再用2 000 mg/L的次氯酸钠消毒液覆盖30 min，75%乙醇擦拭2遍，最后用紫外灯消毒39 min[7]。

3.1.3 废弃物的处理  ①剩余血液的处理：由实验室工作人员在每工作日下午16：00交科洗涤人员连同盛血用的试管一起置黄色垃圾袋中送医疗器具处理公司处理，并记录。②一次性塑料吸管、移液器吸头的处理：实验过程中使用后的一次性塑料吸管、移液器吸头放入含10%次氯酸钠的废物缸中，每天工作结束后，置黄色垃圾袋中交科洗涤人员送医疗器具处理公司处理，并记录。③废弃的扩增产物的处理：置于一次性塑料袋中，再放至黄色垃圾袋中，交专门人员处理，并记录。④使用过的一次性口罩、手套、帽子等，放置于黄色垃圾袋中，交科洗涤人员送医疗器具处理公司，并记录。

3.2  提高PCR实验室的质量控制水平

PCR实验室的质量控制应注意以下几点：①选择质控品时应考虑其浓度、基质、稳定性等特性，表达阴性质控品可作定量试验，表达弱阳性和阴性质控品可作定性试验。②扩大质控品的来源，选择不同厂家的同一种质控品分别做质控试验，对比结果。③为更好地监测每一个孔的扩增有效性，建议对质控品每次扩增的位置進行顺延，顺延规则应在SOP文件中表述清楚。④出现失控后反思问题不能流于表面，应该多从以下几个方面考虑：核酸的提取过程中是否存在误差、扩增时各个反应孔之间的温度升降是否一致、探针的纯度、标记效率是否符合标准、实验人员的技术水平是否达标[8]。⑤缩短质控的试验周期，以便及时发现问题并处理问题。

3.3  加强PCR实验室的规范管理

①设备的管理：仪器设备的管理由实验室负责人组织执行和监督管理。需定期作校准或检定的仪器应有校准。PCR实验室每个分区的仪器设备均为专用。实验人员必须先熟悉掌握仪器的操作流程和相关性能才能使用该仪器，并经实验室负责人考核认可后方可进行仪器操作。主要仪器使用后应做好使用记录和日常维护，如高速冷冻离心机、基因扩增仪等。实验室仪器应由专门人员管理维护，非本室人员在使用仪器时应有专人指导并作好记录。

②人员的管理。实验人员必须严格遵守实验室的各项规章制度和操作流程。由实验室负责人安排本实验室人员的工作，如常规检验工作、设备维修管理、实验室清洁消毒等。新安排人员须经基因扩增技术培训并取得合格证后方可上岗。加强实验人员“无基因、防污染”的概念及生物安全培训。安装门禁系统、气锁连动门等措施来加强管理。实验人员进入实验室路径：公共清洁区—更衣区—缓冲间—污染实验区。实验室人员退出实验室路径：污染实验区—缓冲间—更衣区—公共清洁区，不可逆行。

4  小结

精准医学时代的来临使得医学实践变得越来越个体化，它从每个人在基因、环境等方面的差异，为每位患者提供最适合的治疗。在精准医学不断发展普及的大趋势下，PCR的临床应用也从最初的感染性疾病的检测，到现在肿瘤的诊断与个体化治疗、产前筛查及遗传病诊断等。因此要获得精准的数据就需要严格按照实验室规范来进行工作，及时发现疏漏并改正，不断反思改进，只有规范PCR的临床应用，才能更好地为临床一线服务。

[参考文献]

[1]  任思冲，周海琴，彭萍.大数据挖掘促进精准医学发展[J].国际检验医学杂志，2015，36（23）：3499-3501.

[2]  李园.PCR实验室的消毒与防污染措施[J].检验医学与临床，2010，7（3）：285-286.

[3]  李金明.实时荧光PCR技术[M].北京：人民军医出版社，2007：55-60.

[4]  王露楠，李金明，邓巍，等.HCV RNA RT-PCR测定室间质量评价的研究[J].临床检验杂志，2000，18（5）：281-283.

[5]  肖艳群，蒋玲丽，金中淦，等.定量PCR HBV DNA室间质量评价可接受范围的探讨[J].检验医学，2012，27（6）：503-505.

[6]  郭利华.PCR实验室的污染及控制措施[J].国际检验医学杂志，2016，37（16）：2354-2355.

[7]  Herero R，Castelsague X，Pawlta M，et al.Human papil- lomaviruses and oral caner：the international agencyfor research on cacer multcenter sdudy[J].J NATL Cancer Int，2003，95（1）：1772-1783.

[8]  曾艳芬，陈发林.临床基因扩增检验实验室技术审核中存在的问题分析[J].国际检验医学杂志，2014，35（19）：2711-2712.

（收稿日期：2019-06-19）