5-HT2A受体激动剂DOI改善糖尿病大鼠排尿障碍的实验研究

涂红坚　李玉梅　刘斌　魏世杰　谷宝军

【摘 要】目的：研究5-羥色胺2A（5-HT2A）受体激动剂对糖尿病（diabetesmellitus，DM）大鼠排尿功能障碍的改善作用。方法：选择体重270～300克之间的雌性SD大鼠20只。随机分成两组：实验组10只，建立糖尿病模型;正常对照组10只。8周后进行膀胱内压测定，记录膀胱内压图（cystometrograms，CMGs），并且测量膀胱容量、残余尿量、峰值压力、排尿量等尿动力学参数。静脉注射5-HT2A受体激动剂（2，5-dimethoxy-4-idophenyl）-2-aminopropanehydrochloride（DOI0.01～0.3mg/kg），得到剂量-效应曲线后再给予5-HT2A受体抑制剂酮色林（ketanserin，0.1mg/kg），观察其对DOI的拮抗作用。结果：和对照组相比，DM大鼠膀胱容积变大，残尿量增加，排尿效率降低明显。DOI则能增加DM大鼠的排尿量，同时降低膀胱容及残余尿量，剂量依赖性的提高DM大鼠的排尿效率，同时DOI能延长其排尿时CMGs中的高频振荡波（high-frequencyoscillations，HFOs）持续时间。酮色林（0.1mg/kg）静推后可以逆转DOI的效应。在对照组中，DOI在用药前后对排尿效率的影响无统计学差异。结论：DOI可以剂量依赖性地增强DM大鼠排尿时尿道外括约肌的高频舒张-收缩功能，从而提高排尿效率，改善排尿功能障碍。

【关键词】排尿;5-羟色胺受体;糖尿病;大鼠

【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2019）21--01

糖尿病神经源性膀胱（diabetic neurogenic bladder， DNB）是糖尿病常见的慢性并发症之一，约40%～80%的糖尿病患者可并发此症[1]。目前的观点认为糖尿病神经和血管病变是DNB的主要致病因素[2，3]，使得各种感觉、运动功能减弱及神经反射消失，出现膀胱逼尿肌功能受损、尿道外括约肌弛缓性瘫痪及逼尿肌-括约肌失协调（detrusor sphincter dyssyneria， DSD）[4，5]，其中膀胱逼尿肌功能受损包括逼尿肌收缩无力、反射亢进及无抑制性收缩等，以逼尿肌收缩无力为主[5，6]。导排尿效率低下，发生膀胱容量增大及尿潴留，因大量残余尿和膀胱内高压，进一步引起膀胱输尿管返流，从而损害肾功能。因此，糖尿病引起的排尿障碍的治疗关键在于增强逼尿肌收缩力和改善逼尿肌-括约肌功能失协调。我们利用SD雌性大鼠作为模型，观察5-羟色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）亚型5-HT2A受体激动剂对DNB排尿功能的影响，现报道如下：

1 对象与方法

1.1 动物分组与糖尿病模型的建立 成年SD雌性大鼠20只，重量270～300g，购自上海斯莱克实验动物公司，随机数字表法分为2组：实验组10只，建立糖尿病模型;另外10只设为正常对照组。实验组和对照组分别禁食12h，实验组按65mg/Kg剂量腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ， 美国Sigma公司），对照组用等量生理盐水代替注射，于注药后72h及1周后检查大鼠随机血糖，血糖连续2次超过300mg/dL者为DM模型成功[7]。

1.2 试验方法 ①测定膀胱内压[8]：8周后均进行膀胱内压测定。用乌拉坦（1.3g/Kg，美国Sigma公司）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，在显微镜下将PE-50聚乙烯导管一端置入大鼠左侧颈静脉，另一端过火封闭;再将PE-90聚乙烯导管置入膀胱顶部，缝线固定，另外一端连接三通管，三通管一端连接微泵注射器持续注射室温生理盐水入膀胱诱发排尿，另一端连接压力转换器用于记录CMGs，灌注速度根据大鼠膀胱容量确定（DM大鼠0.6ml/min，对照组大鼠0.1ml/min），排出的尿液收集在连接有重力传感器的容器中。Powerlab多道生理记录仪（澳大利亚AD Instruments公司）采集数据，包括排尿量、残尿量、膀胱容量、排尿效率（排尿量占膀胱容量的百分比）、膀胱峰值压力（排尿时膀胱内最大压力，Peak P），同时计算HFOs持续时间（t-HFOs）。2.实验方法：DM组及对照组大鼠均需记录三次连续相似的排尿波形，同时记录上述各值。然后通过已置入颈静脉的聚乙烯PE-50导管，注入DOI（美国Sigma公司），剂量从0（空白生理盐水对照）开始，并连续追加DOI剂量直至0.3mg/kg，再给予5-HT2A受体选择性抑制剂酮色林（Ketanserin，美国Sigma公司）0.1mg/kg，记录上述测压参数;测压完成后，从下腹正中切口暴露膀胱，分离结扎双侧输尿管，尽量远离膀胱颈部离断尿道，完整取出膀胱，立即切除膀胱，吸净水分，电子天平称重。

1.3 统计学方法 所有数据以表示，采用SPSS16.0统计软件进行数据处理和统计分析。两组大鼠给药前后尿动力学参数的变化比较用随机区组方差分析，两两间比较采用LSD检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组大鼠成模结果及与对照组差异 实验组10只大鼠中2只因低血糖而被弃用，8只建模成功。以下为8周后成模DM大鼠和正常对照组大鼠血糖浓度、体重及其膀胱体积等的比较（表1）

2.2 DOI对正常大鼠排尿的影响 对照组大鼠，排尿量为0.38±0.08ml，膀胱容量为0.46±0.08ml，残余尿量为0.08±0.00ml，膀胱峰值压力峰值为20.6±4.3cmH2O，平均排尿效率为83.2±3.1%。使用DOI后，随着剂量的增加，对照组大鼠的排尿量、膀胱容量呈下降趋势，DOI剂量为0.1和0.3mg/kg时与生理盐水组间比较的差异有统计学意义（P<0.05），而其他值的变化差异无明显统计学意义。酮色林（0.1mg/kg）对正常大鼠的残尿量、膀胱容积及排尿效率也有一定逆转作用，见表2。

2.3 DOI对DM大鼠排尿的影响

如表3所示，随着DOI剂量增加，DM大鼠排尿量由1.88±0.05ml增加到2.88±0.43ml，残余尿量由3.46±0.78ml下降到1.58±0.37ml，膀胱容量由5.20±0.80ml下降到4，46±0.36ml，膀胱峰值压力由35.5±7.1cmH2O下降到29.3±6.4cmH2O，HFOs持续时间由7.1±1.0s上升到9.2±0.9s，且酮色林（KET， 0.1mg/kg）能逆转DOI的作用。DM大鼠排尿效率由35.2±10.5%增加到65.6±8.4%，使用酮色林（KET， 0.1mg/kg）后又下降至36.6±6.8%。DOI剂量为0.03～0.30mg/kg时，糖尿病大鼠的残尿量、膀胱容量、排尿效率及膀胱峰值压力、HFOs持续时间的变化与生理盐水组间比较差异均有统计学意义（P<0.05），排尿量在DOI剂量为0.1～0.30mg/kg时有统计学意义（P<0.05）。

2.4 DOI对大鼠CMGs的影响

正常大鼠经膀胱灌注诱导膀胱收缩时产生的CMGs如图1A所示，波形呈钟形，整体较平滑。正常大鼠排尿时每个周期可分为三个阶段：膀胱内压力（intravesical pressure， IVP）上升期;高频振荡期（HFOs，图1B）;IVP再次上升后下降期。HFOs期是尿液排出的主要时期，且HFOs由多个小振荡波组成，波形成锯齿样。糖尿病大鼠排尿时CMGs中HFOs活动减弱且锯齿样结构紊乱，小振荡波振幅减小（图1D）。

静脉给予DOI后，DM大鼠排尿时HFOs活动呈剂量依赖性增强。排尿时CMGs上HFOs持续时间由7.2±1.0sec增加到9.2±0.9sec，且HFOs的振幅呈浓度依赖性变大，锯齿样波形加深，酮色林（KET， 0.1mg/kg）能逆转DOI的作用，差别有统计学意义（P<0.05，图2）。

讨论

正常大鼠在储尿过程中膀胱充盈时，膀胱逼尿肌开始舒张，尿道外括约肌相应收缩，直到膀胱充盈到一定程度开始排尿，膀胱逼尿肌收缩，尿道外括约肌出现协调性松弛，故下尿路正常的排尿和储尿功能依赖于膀胱、尿道外括约肌以及尿道三者的协同作用[4，9-11]。正常大鼠排尿时尿道外括约肌的活动为高频舒张收缩，表现为强直性收缩间出现阶段性松弛，使大鼠的尿道能像“泵”一样有效的排空尿液[12]。

DM成模过程中有2只大鼠出现低血糖，考虑STZ腹腔注射后胰岛β细胞破坏，大量胰岛素释放而引起低血糖[7]。DM引起大鼠下尿路功能损害在STZ腹腔注射后5-10周出现[13]，其引起排尿功能障碍主要由两部分的原因构成：（1）糖尿病导致神经和血管发生病变，使得机体各种感觉、运动功能减弱及神经反射消失，引起尿道外括约肌功能失调，使得排尿时尿道外括约肌的协调性收缩舒张的能力下降，排尿时出口的阻力增加，因此降低了排尿效率;（2）膀胱逼尿肌收缩无力，王新民等认为膀胱逼尿肌收缩和心肌有相似之处，都存在“Starling 机制”和“球体原理”[14]，即在一定的范围内，随着膀胱的容积增加，膀胱的收缩力会随之增大，但超过代偿范围，膀胱收缩出现失代偿，收缩力下降。膀胱收缩力下降可进一步加重排尿功能障碍，恶化膀胱收缩功能，造成肾脏损害[15]。

本研究结果显示，静脉给予5-HT2A受体激动剂DOI后剂量依赖性的提高了排尿效率。推测其可能的原因为：（1）大鼠尿道外括约肌分布有5-HT2A受体[16-19]，DOI部分恢复了DM大鼠排尿时尿道外括约肌的阶段性松弛，相对延长了排尿过程中尿道外括约肌“开放”的时间，尿动力学上表现为高频振荡波的活动增强，HFOs的持续时间延长; （2）同时不能排除DOI对膀胱收缩的直接兴奋作用，因為5-HT2A受体激活后能加强离体状态下膀胱肌条的收缩力[20]。

膀胱峰值压力的水平可以反映膀胱收缩力的高低，理论上DOI可使膀胱峰值压力增高，但本实验研究结果表明，DOI能剂量依赖性的降低膀胱峰值压力。这并不矛盾，因为DOI能促进尿道外括约肌的松弛，使得出口的阻力降低，“泵”样作用增强，膀胱仅需要更小的收缩力就能将尿液排出。此作用可被5-HT2A受体拮抗剂酮色林逆转，进一步提示大鼠排尿时尿道外括约肌出现阶段性松弛很可能取决于下行5-HT对5-HT2A受体的作用，而DM大鼠与正常大鼠尿道外括约肌5-HT2A受体分布的差异则需要更加深入的分子水平研究予以证明。

正常大鼠使用DOI后，大鼠膀胱容量呈剂量依赖性减小，这可能是由于5-HT2A受体激动剂能够促进排尿反射，使膀胱容量阈值下降。然而，DOI对正常大鼠排尿时HFOs的活动影响甚微，且正常大鼠的排尿效率并未发生明显变化。正常大鼠尿道外括约肌高频舒张收缩活动已经能够有效完成正常排尿，因此DOI对正常大鼠膀胱压力基本无影响。正常大鼠在给药前，已经存在良好的尿道外括约肌高频舒张收缩活动，如果完全阻断尿道外括约肌的收缩以延长松弛时间，反而损失了尿道的“泵”样作用，故不能提高排尿效率。

本实验研究表明，5-HT2A受体激动剂DOI可改善DM大鼠的排尿功能障碍，提高排尿效率。而DOI能否改善DNB病人的排尿功能，提高其生活质量，则需要更加深入的研究。

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