Mesenterocin ZLG85 对金黄色葡萄球菌抗菌机制研究

李大鹏，高玉荣，张凤琴，方 舒，彭 贞，宋俊梅

（巢湖学院化学与材料工程学院，安徽合肥 238000）

0 引言

乳酸菌细菌素是由乳酸菌代谢产生的多肽或蛋白质，对其他微生物具有抑制或杀死作用，是天然安全的生物防腐剂[1]。开发安全无毒的新型生物防腐剂取代化学防腐剂是食品添加剂工业的重要发展方向[2]。

目前，国内外主要对Ⅰ类和Ⅱ类乳酸菌细菌素进行了抗菌机理的研究，采用的靶细胞主要是金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌等革兰氏阳性细菌。目前，发现部分乳酸菌的主要作用机制是导致细胞内大分子和小分子物质的渗漏，引起质子驱动势的丧失，提高细胞膜的通透性，最终导致细胞的死亡[3-4]。

肠膜明串珠菌能将糖代谢产生酸和醇，已被广泛应用于泡菜等蔬菜的发酵中，还有望成为新型微生态制剂，是公认安全的乳酸菌发酵剂。目前，已发现极少数肠膜明串珠菌也能产生细菌素[5-7]，但关于肠膜明串珠菌素的抗菌机制的研究目前还鲜见报道。

课题组从发酵酸黄瓜中分离到产细菌素的Leuconstoc mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85，对其产生的细菌素Mesenterocin ZLG85 进行了分离纯化和性质研究，发现这是一种新型广谱乳酸菌细菌素，具有作为新型生物防腐剂的应用前景[8-9]。试验以金黄色葡萄球菌为模式菌株，探讨肠膜明串珠菌素Mesenterocin ZLG85 对金黄色葡萄球菌的抗菌机制，为其在食品防腐中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Leuconstoc mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85，从发酵黄瓜中分离[8]；金黄色葡萄球菌ATCC6538，购于中科院微生物研究所。

培养基：MRS 培养基、营养肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司提供。

试剂：3,3 - 二丙基- 二碳菁碘化物、尼日利亚菌素，美国Sigma 公司提供；碘化丙啶、缬氨霉素，北京沃凯生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

LS55 型荧光分光光度计，美国Perkin Elmer 公司产品；EPICS-XL 型流氏细胞仪，美国BD 公司产品；TU-1810 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将1～2 环肠膜明串珠菌ZLG85 斜面菌种，接种于MRS 固体斜面培养基上，于30 ℃下静置培养18～24 h。

1.3.2 菌种液体培养

将1～2 环活化好的肠膜明串珠菌ZLG85 斜面菌种接种于50 mL MRS 液体培养基中，在30 ℃下以转速100 r/min 培养18～24 h。

1.3.3 肠膜明串珠菌素Mesentericin ZLG85 的制备

将Leuconstoc mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85 的培养液，在80 ℃下热灭菌15 min，以转速8 000 r/min 离心15 min，取上清液。将上清液通过旋转蒸发浓缩、乙醇沉淀粗提、Sephadex G50 柱层析进行初步纯化，收集抗菌活性组分，通过SP Sepharose 离子交换柱进一步纯化，冻干后备用。

1.3.4 肠膜明串珠菌素Mesentericin ZLG85 对金黄色葡萄球菌抗菌机制分析

（1） Mesentericin ZLG85 对细胞紫外吸收物质渗漏的影响。将金黄色葡萄球菌的过夜培养物，离心收集菌体（6 000 r/min，15 min），用无菌水对金黄色葡萄球菌细胞悬浮液洗涤2 次，重悬制成细胞悬浮液，添加肠膜明串珠菌素Mesenterocin ZLG85，使终浓度为320 AU/mL，在36 ℃下处理0，10，20，30，40，50，60 min，微孔滤膜 （0.22 μm） 过滤，于波长260 nm 和280 nm 处采用紫外可见分光光度计测定上清液的吸光度，以添加无菌蒸馏水的样品为空白对照。紫外吸收物质的渗漏用处理后上清液吸光度与初始吸光度的差值（ΔOD） 来表示。

（2） Mesentericin ZLG85 对细胞膜电势 （ΔΨ） 的影响。离心收集过夜培养的金黄色葡萄球菌的细胞，用磷酸盐- 4 - 羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液（0.002 5 mol/L，pH 值7.0） 对金黄色葡萄球菌细胞进行清洗，重悬于相同的缓冲溶液中，添加葡萄糖（0.1 mol/L），再加入3,3 - 二丙基- 二碳菁碘化物（DISC3（5）） （0.4 μmol/L） 混合后，分别添加尼日利亚菌素 （0.1 μmol/L），缬氨霉素 （1 μmol/L） 和肠膜明串珠菌素Mesentericin ZLG85（终浓度320 AU/mL）。以添加无菌蒸馏水的细胞悬浮液作为空白对照。采用荧光分光光度计，于激发波长622 nm 和发射波长670 nm 处测定荧光值[10]。

（3） Mesentericin ZLG85 对细胞通透性的影响。取培养液10 mL 培养到对数期的金黄色葡萄球菌（OD6000.8～1.0），离心收集菌体（6 000 r/min，15 min），用pH 值6.5 的无菌磷酸缓冲溶液清洗2 次。用肠膜明串珠菌素Mesenterocin ZLG85（终浓度320 AU/mL）在37 ℃下处理30 min 和60 min 后，离心收集菌体（6 000 r/min，15 min）。以碘化丙啶（PI） 为染色剂，以金黄色葡萄球菌细胞悬浮在无菌蒸馏水中为空白对照，用流式细胞仪测定荧光强度[6]。

1.4 统计分析

每次试验2 个平行样品，所有试验进行3 次独立重复试验。数据分析采用SAS software（Version 8.1） 进行。

2 结果与分析

2.1 肠膜明串珠菌素Mesenterocin ZLG85 对金黄色葡萄球菌紫外吸收物质渗漏的影响

Mesenterocin ZLG85 对金黄色葡萄球菌在波长260 nm 和280 nm 处紫外吸收物质渗漏的影响见图1。

图1 Mesenterocin ZLG85 对金黄色葡萄球菌在波长260 nm和280 nm 处紫外吸收物质渗漏的影响

目前，常用260 nm 和280 nm 这2 个波长下的吸光度分别代表核酸和蛋白的浓度。由图1 可以看出，未用细菌素Mesenterocin ZLG85 处理的空白样品中，60 min 后金黄色葡萄球菌细胞悬浮液在260 nm 和280 nm 下的 ΔOD 值分别提高到0.10 和0.05；而用细菌素Mesenterocin ZLG85 处理革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌60 min 后，在260 nm 和280 nm 下的

ΔOD 值分别提高到0.54 和0.64。以上试验结果表明，细菌素Mesenterocin ZLG85 导致了金黄色葡萄球菌细胞内波长260 nm 和280 nm 处紫外吸收物质的大量渗漏。

2.2 Mesenterocin ZLG85 对金黄色葡萄球菌ΔΨ 的影响

Mesenterocin ZLG85 处理金黄色葡萄球菌后DISC3（5）荧光强度值见图2。

图2 Mesenterocin ZLG85 处理金黄色葡萄球菌后DISC3（5）荧光强度值

荧光探针DISC3（5）可用来测定微生物细胞的转膜电势Δψ。如果微生物细胞的转膜电势被破坏，将导致细胞转膜电势Δψ 消散，使DISC3（5）释放到培养基中，从而引起培养液中荧光强度的提高。试验结果表明，不添加细菌素Mesenterocin ZLG85 的空白对照样品中，金黄色葡萄球菌的转膜电势基本没有耗散，与阴性对照Nigericin 相当；而在金黄色葡萄球菌培养液中添加了细菌素Mesenterocin ZLG85 后，引起了金黄色葡萄球菌转膜电势Δψ 的快速耗散，耗散速度与阳性对照Valinomycin 相当。这说明细菌素Mesenterocin ZLG85 能引起革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌细胞转膜电势Δψ 的耗散。

2.3 Mesenterocin ZLG85 对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响

流式细胞仪检测Mesenterocin ZLG85 作用的细胞通透性影响见表1。

表1 流式细胞仪检测mesenterocin ZLG85 作用的细胞通透性影响

进入细胞的碘化丙啶越多，其MnX（平均荧光道数） 值越大。碘化丙啶能与DNA 结合产生荧光，荧光强度越大，说明细胞膜的孔隙越大，通透性越好。由表1 可以看出，与不用细菌素作用的对照样品相比，用320 AU/mL 的细菌素Mesenterocin ZLG85作用革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌后30 min 和60 min 后，MnX 从2.86 分别提高到6.33 和7.52。因此，用320 AU/mL 的细菌素Mesenterocin ZLG85作用于金黄色葡萄球菌，能引起其细胞膜通透性的增大。

3 结论

以金黄色葡萄球菌为模式菌株，采用紫外可见分光光度计、荧光分光光度计、流式细胞仪，通过对紫外吸收物质渗漏、转膜电势及细胞膜通透性的影响，探讨肠膜明串珠菌素ZLG85 对革兰氏阳性菌细菌的抗菌机理。结果表明，肠膜明串珠菌素ZLG85 对金黄色葡萄球菌的抗菌机理是其导致金黄色葡萄球菌紫外吸收物质的渗漏和转膜电势Δψ 的消散，并导致金黄色葡萄球菌细胞通透性增大，最终导致细胞死亡。