不同生态因子对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

盖春蕾，许 拉 ，樊 英，于晓清，叶海斌，王 西，曹海鹏

( 1.山东省海洋生物研究院，山东省海水养殖病害防治重点实验室，山东 青岛 266002； 2.上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海 201306 )

卤虫(Artemia)无节幼体卵黄含有较多蛋白质和脂肪，是水产育苗过程中必不可少的生物饵料，占育苗成本的50%～70%，深受虾苗场的重视[1]。近年来，我国在卤虫的繁殖、卤虫卵的孵化技术及其作为生物饵料对养殖动物的应用研究方面做了大量的工作[2-9]。然而，卤虫卵孵化出无节幼体过程中，其孵化水体(暂名：卤虫卵孵化水体)中易滋生大量弧菌(Vibrio)，导致卤虫无节幼体受弧菌污染问题越来越突出，严重影响了作为水产种苗生物饵料的卤虫质量，而影响卤虫卵孵化的盐度、pH、孵化密度等一些重要生态因子[10]对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响却鲜有报道，这极大地阻碍了优质卤虫的生产进程。鉴此，本试验观察了脱壳时间、盐度、pH、抑菌微生物制剂、孵化密度等生态因子对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响，以期为优质卤虫的培育奠定重要的技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

卤虫卵(无棣海吉水产有限公司)；漂白液(江西草珊瑚消毒用品有限公司)；硫代硫酸钠溶液，有效含量为2%(上海傲之珊实业发展有限公司)；硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂平板(上海绿奥生物科技有限公司)；碳酸钠[国药集团(上海)化学试剂有限公司]；抑菌微生物制剂，主要成为为复合抑菌微生物(上海绿奥生物科技有限公司)；海水晶(浙江蓝海星制品有限公司)；根据海水晶说明书配制的盐度为15、20、25、30、35的人工海水，均于121 ℃灭菌20 min，冷却备用。

1.2 脱壳液的配制

参照文献[5]的方法配制。即425 g干虫卵对应的脱壳液组成为漂白液1700 mL、氢氧化钠30 g、水3400 mL。具体配制用量根据卤虫卵的质量计算。

1.3 脱壳时间对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

参照文献[11]建议的1 g/L孵化密度将卤虫卵在脱壳液中进行脱壳处理5、10、15、20、25 min，接着用硫代硫酸钠溶液去除余氯，然后将卤虫脱壳卵放入盐度20、pH 8.0的人工海水中，置于30 ℃恒温光照培养箱并利用小型增氧机进行恒温增氧孵化，孵化24 h后，检测卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。弧菌密度的检测方法采用稀释涂布硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂平板法。每个处理设3个平行。

1.4 盐度对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

参照文献[11]建议的1 g/L孵化密度将卤虫卵在脱壳液中进行脱壳处理10 min，接着用硫代硫酸钠溶液去除余氯，然后将卤虫脱壳卵放入盐度分别为15、20、25、30、35，pH为8.0的人工海水中，置于30 ℃恒温光照培养箱并利用小型增氧机进行恒温增氧孵化，孵化24 h后，检测卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。弧菌密度的检测方法采用稀释涂布硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂平板法。每个处理设3个平行。

1.5 pH对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

参照文献[11]建议的1 g/L孵化密度将卤虫卵在脱壳液中进行脱壳处理10 min，接着用硫代硫酸钠溶液去除余氯，然后将卤虫脱壳卵放入盐度为20，pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的人工海水中，置于30 ℃恒温光照培养箱中，用小型增氧机进行恒温增氧孵化，孵化24 h后，检测卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。弧菌密度的检测方法采用稀释涂布硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂平板法。每个处理设3个平行。

1.6 抑菌微生物制剂对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

参照文献[11]建议的1 g/L孵化密度将卤虫卵在脱壳液中进行脱壳处理10 min，接着用硫代硫酸钠溶液去除余氯，然后将卤虫脱壳卵放入盐度为20，终质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的抑菌微生物制剂，pH为8.0的人工海水中，置于30 ℃恒温光照培养箱并利用小型增氧机进行恒温增氧孵化，在孵化24 h后检测卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。弧菌密度的检测方法采用稀释涂布硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂平板法。每个处理设3个平行。

1.7 孵化密度对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

将孵化密度分别0.25、0.5、1、2、4 g/L的卤虫卵在脱壳液中进行脱壳处理10 min，随后用硫代硫酸钠溶液去除余氯，然后将卤虫脱壳卵放入盐度20、pH 8.0的人工海水中，置于30 ℃恒温光照培养箱并利用小型增氧机进行恒温增氧孵化，孵化24 h后，检测卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。弧菌密度的检测方法采用稀释涂布硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂平板法。每个处理设3个平行。

1.8 数据统计与分析

试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，Duncan′s检验法进行多重比较，P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 脱壳时间对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

脱壳处理10 min时，卤虫卵孵化水体中的弧菌密度最低(3.4×104cfu/mL)，分别较在脱壳处理5、15、20、25 min后的卤虫卵孵化水体中的弧菌密度减少22.87%(P>0.05)、79.56%(P<0.05)、73.94%(P<0.05)和65.50%(P>0.05)(图1)。因此，脱壳处理10 min更有利于减少卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。

图1 脱壳时间对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响图中小写字母不同表示差异显著(P<0.05).下同.

2.2 盐度对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

盐度为35时，卤虫卵孵化水体中的弧菌密度最低(5.6×104cfu/mL)，分别较盐度为15、20、25、30时的卤虫卵孵化水体中的弧菌密度减少69.89%(P<0.05)、93.92%(P<0.05)、94.97%(P<0.05)和6.47%(P>0.05)(图2)。因此，盐度为35时有利于减少卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。

2.3 pH对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

pH为9.0时卤虫卵孵化水体中的弧菌密度最低(7.5×103cfu/mL)，分别较pH为7.0、7.5、8.0、8.5时卤虫卵孵化水体中的弧菌密度减少46.43%(P>0.05)、39.02%(P>0.05)、98.12%(P<0.05)和93.12%(P<0.05)(图3)。因此，pH为9.0时更有利于减少卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。

图2 盐度对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

图3 pH对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

2.4 抑菌微生物制剂对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

抑菌微生物制剂使用时，卤虫卵孵化水体中弧菌密度显著降低。抑菌微生物制剂在用量为0.2～1.0 mg/L时，卤虫卵孵化水体中弧菌密度较对照组减少70.12%～74.27%(P<0.05)(图4)。其中，抑菌微生物制剂用量为1.0 mg/L时卤虫卵孵化水体中的弧菌密度最低(4.5×104cfu/mL)，分别较用量为0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L时卤虫卵孵化水体中的弧菌密度减少2.83%(P>0.05)、9.42%(P>0.05)、13.87%(P>0.05)和1.54%(P>0.05)。因此，抑菌微生物制剂的使用有利于减少卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。

2.5 孵化密度对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

试验结果见图5。孵化密度为0.25 g/L时卤虫卵孵化水体中的弧菌密度最低(1.2×104cfu/mL)，分别较孵化密度为0.50、1、2、4 g/L时卤虫卵孵化水体中的弧菌密度减少32.79%(P>0.05)、96.42%(P<0.05)、95.55%(P<0.05)和99.12%(P<0.05)。因此，孵化密度为0.25 g/L更有利于减少卤虫卵孵化水体中的弧菌密度。

图4 抑菌微生物制剂对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

图5 孵化密度对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响

3 讨 论

卤虫卵孵化出的无节幼体应用于水产育苗已经纳入了我国水产育苗技术规范(GB/T 30890—2014)，但有报道指出，卤虫卵孵化过程中的弧菌滋生增加了水产种苗弧菌污染的风险[12]。因此，卤虫卵孵化水体中弧菌滋生对卤虫无节幼体的污染问题必须予以重视。这是国内首次报道不同生态因子对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响，本研究对优质卤虫的培育、减少弧菌对卤虫的污染具有指导意义。

3.1 脱壳时间

脱壳是卤虫卵孵化的重要步骤。由于脱壳卵较不脱壳卵具有更高的孵化率，所以生产上通常对卤虫卵进行脱壳处理。本试验发现，卤虫卵在脱壳时间为10 min时其孵化水体中弧菌密度最低，但水体中弧菌密度的变化未表现出明显的规律性，尤其是脱壳时间在15～25 min时，水体中弧菌密度反而增加。究其原因，可能是因为脱壳时间延长会导致死卵增多，死卵含有丰富的蛋白质，其腐化分解进而导致孵化过程中水体弧菌滋生。研究表明，卤虫卵在脱壳时间为10 min和15 min时孵化率较高[11]。因此，为了生产上既要达到高孵化率，同时又要减少卤虫卵孵化水体中弧菌密度，建议脱壳时间选取10 min。

3.2 盐度、pH

卤虫脱壳卵在不同盐度的水体中的孵化率不同。廖永岩等[11]认为，卤虫卵可以通过改变自身的代谢状况适应不同盐度的水体，并指出，卤虫脱壳卵在盐度为35时孵化率最高。此外，pH对卤虫卵孵化也具有重要的影响。一般情况下，卤虫卵在孵化时，对孵化用水的pH要求在7.5～11.0，最佳pH为8.5～11.0[13-14]。本试验结果表明，在盐度为35、pH为9的卤虫卵孵化水体中弧菌密度最低。因此，考虑到生产上既要达到高孵化率，同时又要尽量减少卤虫卵孵化水体中弧菌的污染，建议孵化用水的盐度选取35、pH选取9。

3.3 抑菌微生物制剂

卤虫对水产用化学杀菌剂极其敏感。薛俊增等[15]研究表明，硫酸锌、硫酸铜对卤虫的96 h半致死质量浓度分别为0.55、0.05 mg/L。因此，生产上一般不采用化学杀菌剂处理卤虫卵孵化水体中的弧菌，这也是本试验选取安全无毒的抑菌微生物制剂对卤虫卵孵化水体中弧菌进行处理的原因。本次试验结果表明，抑菌微生物制剂在用量为0.2～1.0 mg/L时，使卤虫卵孵化水体中弧菌密度降低了70.12%～74.27%。根据农业部发布的《渔药临床试验技术规范》中关于养殖环境改良剂效果评价标准[16]，能使主要指标改善50%以上为显效，10%～40%为有效，10%以下为无效，说明抑菌微生物制剂对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的控制效果为显效。考虑到生产上抑菌微生物制剂的使用成本，建议用量为0.2 mg/L。

3.4 孵化密度

卤虫卵在生产上的孵化都是在高密度下进行的[17]，但高孵化密度并不一定产生高孵化率。赵乃刚[18]观察了不同孵化密度(0.1～2 g/L)对卤虫卵孵化率的影响，结果表明，以0.1 g/L时的孵化率最高，说明孵化密度低更有利于提高卤虫卵的孵化率。此外，在卤虫卵孵化过程中空气等介质向卤虫卵孵化水体中引入了大量弧菌[19]。由于卤虫卵含有丰富的蛋白质[20]，卤虫卵壳也是一种含铁脂蛋白，含有58.91%蛋白质和多种无机元素[21]，卤虫卵在孵化过程中因孵化密度高导致出现大量死卵与积累的卤虫卵壳，这无疑为弧菌滋生提供了丰富的营养，极易使弧菌在条件适宜的孵化水体中快速繁殖起来。因此，应该考虑孵化密度对卤虫卵孵化水体中弧菌密度的影响。本试验发现，在孵化密度最小(0.25 g/L)时卤虫卵孵化水体中的弧菌密度最低，再加上孵化密度低更有利于提高卤虫卵的孵化率[18]，故为了提高孵化率，减少卤虫卵孵化水体中的弧菌污染，建议生产上选择低孵化密度。