逆流浸泡玉米浆中微生物的变化及其作用研究

金渭武 焦琳 沈雪梅 陈博 李义 陶进 佟毅

摘      要： 逆流浸泡工艺已被广泛应用于玉米湿法淀粉生产中。玉米逆流浸泡中微生物会不断生长、繁殖，代谢并产生活性物质作用于玉米籽粒，提高浸泡效果。但目前对玉米浸泡过程中微生物的变化规律及其作用研究不多。采集了中粮生化龙江工厂中两批6个不同时间段的玉米浸泡液（2、10、18、26、33和41 h）共12个样品，测定其有机酸组成、pH和细菌群落结构变化，浸泡液中的有机酸含量和pH都随着浸泡时间逐渐降低，乳酸含量从30 g/L左右（2 h）降低到<10 g/L（41 h），pH维持在4.0±0.2。整个浸泡过程中，乳酸杆菌属占绝对优势并在浸泡前期发酵产生大量乳酸，从2到41 h占比分别为95.8%，89.6%，76.1%，77.9%，52.2%和 58.4%。芽孢杆菌属丰度从浸泡10 h开始上升并成为第二优势菌。

关  键  词：逆流浸泡;乳酸;乳酸菌;微生物群落结构

中图分类号：TQ 033       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）06-1228-04

Abstract： The countercurrent steeping of corn has been widely used in the production of starch. During the corn soaking， lactic acid bacteria fermentation broth was added to increase the soaking effect of corn and reduce the use of sulphur. In this paper， 12 samples of 6 batches of corn soaking liquid （2， 10， 18， 26， 33 and 41 h） were collected from COFCO biochemical Longjiang factory. The organic acid composition， pH and bacterial composition were determined. Both the concentration of organic acid and the pH gradually decreased with time. The lactic acid concentration decreased from about 30 g/L （2 h） to <10 g/L （41 h）， and the pH maintained at 4.0 ± 0.2. During the whole soaking process， Lactobacillus was dominant， accounting for 95.8%， 89.6%， 76.1%， 77.9%， 52.2% and 58.4%， respectively， from 2 h to 41 h. The abundance of Bacillus increased from 10 h as the second dominant bacteria.

Key words： Countercurrent steeping; Lactic acid; Lactic acid bacteria; Microbial community

玉米淀粉生產工艺主要分为干法工艺和湿法工艺两种，干法工艺较湿法工艺所得产品中蛋白质、脂肪含量高，淀粉纯度低，因此目前淀粉生产主要采用湿法工艺。而湿法玉米淀粉生产工艺因为浸泡方式不同又分为静止浸泡法和逆流浸泡法。相对于静止浸泡法，逆流浸泡法使玉米与浸泡液中可溶性物质始终保持较大的浓度差以利于玉米中可溶性物质向浸泡液中转移，从而能更好地降低浸泡玉米中的可溶性物质含量，便于在洗涤时彻底除去残余的可溶性物质，提高淀粉纯度。因此，逆流浸泡法被湿法玉米淀粉生产工厂广泛采用[1]。

许多研究表明，在玉米浸泡液中添加乳酸可显著缩短玉米淀粉生产的浸泡时间，降低亚硫酸的使用浓度[2，3]。而玉米浸泡过程不仅仅是物理扩散过程，也是生物化学变化的过程。在浸泡工艺条件下，温度、酸度等都非常适合微生物尤其是乳酸菌的生长。因此，浸泡过程也是乳酸菌发酵产生乳酸的过程，这也是玉米浸泡中没有外加乳酸而浸泡液中会含有较高乳酸的原因。另外研究也表明外接一定比例的乳酸菌发酵液可以大大缩短玉米浸泡的时间，提高玉米浸泡液的质量[4，5]。基于乳酸菌发酵产生乳酸提高玉米浸泡效果，降低二氧化硫的使用量。在湿法玉米淀粉生产中，赵寿经等采用从玉米浸泡液中分离的一株嗜热乳酸菌C15，通过发酵罐培养后再接种到玉米浸泡液中，使吨玉米淀粉产出的硫磺用量大幅降低[4]。同时玉米浸泡也是微生物生长、繁殖，新陈代谢产生各种活性物质并作用于玉米籽粒的过程。但迄今为止，玉米浸泡过程中微生物的群落变化并没有被系统地研究过。本文通过对中粮生化工厂玉米湿法淀粉生产中，不同时间段的玉米逆流浸泡液进行采样，测定其有机酸组成、pH 值及其微生物组成，系统分析玉米浸泡中微生物群落结构变化，探讨其在玉米浸泡中的作用。

1  实验部分

1.1  实验材料

玉米浸泡液分别取自中粮生化龙江公司玉米浸泡车间2#罐和7#罐，两罐时间间隔为2 d。准备50 mL灭菌离心管12个，待玉米入罐后，在同一浸泡罐中分别于 2、10、18、26、33和41 h 取玉米浆1管（50 mL/管），取样后迅速冷冻保存，以备提取细菌基因组和各种指标测定。

1.2  仪器设备

仪器：安捷伦1260，色谱柱：Bio-RadAminex

HPX-87HColumn（300 mm×7.8 mm 8 μm），BioTeke自动核酸提取仪（百泰克，北京），NanoDrop 2000C（美国Thermo），Eppendorf 离心机。

1.3  实验方法

1.3.1  玉米浸泡液有机酸测定

玉米浸泡液中有机酸的测定参照贾铮等[6]液相方法略作修改，以5 mM 硫酸溶液为流动相，流速0.50 mL/min，柱温55 ℃，DAD检测波长为210 nm，以保留时间结合待测物质的紫外特征吸收光谱进行定性分析，结合外标法进行定量。液相样品制作如下：待玉米浸泡液完全解冻摇匀，取100 μL浆液加入2.4 mL双蒸水稀释25倍，13 000 r/min离心3 min取上清，过水系液相膜放入液相瓶中，标记好样品名称，上机检测。

1.3.2  细菌基因组提取

取10 mL 玉米浸泡液12 000 r/min离心5 min，弃上清，使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒（北京BioTeke）在AU1001-96核酸提取仪（北京BioTeke）上进行样品的DNA提取。提取的DNA利用1%的琼脂糖凝胶上进行检测，使用2000C NanoDrop（美国Thermo）检测浓度。利用干冰将浓度合格的样品（浓度≥50 ng/μL，体积>30 μL）寄送上海派森诺生物科技有限公司进行16S rDNA 的V3-V4区域扩增、测序及数据分析。

2  结果与分析

2.1  玉米浸泡液中的有机酸及pH变化

两批样品的液相结果都显示逆流浸泡液中的有机酸含量随浸泡时间的增加而逐渐降低，乳酸浓度从2 h 的将近30 g/L逐渐变为41 h的不到10 g/L。前18 h玉米浆中乳酸含量维持在较高水平（>15 g/L），浸泡到26 h，玉米浆中的乳酸含量也还大于10 g/L（见表1）。浸泡液中乳酸含量大幅降低主要发生在2～10 h，而33～41 h乳酸含量降低不明显。另外随着浸泡时间的增加，浸泡液的pH进一步下降，但在整个浸泡过程中维持窄幅变动（4.0 ±0.2）。

玉米逆流浸泡过程中玉米始终留在罐内，用泵将浸泡液在罐内一边自身循环一边向前一级罐内输送，始终保持新的亚硫酸溶液与浸泡时间最长（即将结束浸泡）的玉米接触，而新入罐的玉米与即将排出的浸泡液接触，从而保持最佳的浸泡效果。因此，随着时间的增加，浸泡液中的SO2会不断升高，尽管有机酸含量降低，但浸泡液的pH值还会逐渐降低。另外，在逆流浸泡中，随着浸泡时间的延长，浸泡液中的糖类、氨基酸等有机浸出物越来越少，浸泡液作为细菌发酵培养基营养越来越贫瘠，不利于微生物的生长繁殖，发酵产生的乳酸少。同时由于浸泡液中SO2浓度的提高，也会抑制乳酸菌的生长。基于两者叠加作用，在浸泡后期，乳酸的含量保持在相对较低的水平。

2.2  浸泡过程中的细菌群落结构变化

2.2.1  门水平上的细菌群落结构变化

在整个浸泡过程中厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势细菌，且厚壁菌门占绝对优势（始终>73.3%）。随着浸泡时间的延长，硬壁菌门丰度逐渐降低，变形菌门丰度逐渐增加，从2 h时的3.8%增加到41 h时的24% 。同时，放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度也随浸泡时间的增加而上升。当浸泡时间为33 h时，放线菌门丰度达到最高，约为2.0%（见图1）。

2.2.2  属水平上的细菌群落结构变化

从属的水平看，整个浸泡过程中乳酸杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）和链球菌属（Streptococcus）为优势菌，其中乳酸杆菌属占绝对优势（从2 h到41 h分别占比为95.8%， 89.6%， 76.1%，77.9%， 52.2% 和 58.4%）。浸泡10 h后，芽孢杆菌属细菌丰度开始增加（占1.5%），18 h后基本稳定在9.5%左右，33 h后丰度维持在12.0%左右。当浸泡33h时，物种多样性明显较高，链球菌属、苍白杆菌属（Ochrobactrum）和肠球菌属（Enterococcus）的丰度均达到较高丰度，而后降低（见图2）。

2.2.3  细菌群落结构变化与有机酸含量相关性

随着浸泡时间的延长，浸泡液逐渐从老酸液更换为新酸液，乳酸含量也不断下降（表1），而乳酸杆菌占比与乳酸含量呈强正相关（R2=0.86）。这表明在浸泡过程中乳酸杆菌发育较好，并发酵产生大量乳酸，这也是连续浸泡过程中，未添加外源乳酸，当浸泡液在逐渐变老时（逆向，从41到2 h）乳酸含量大量增加的原因。同时，反观41到2 h，浸泡液中的SO2浓度的逐渐降低，这有利于乳酸杆菌发酵，而乳酸杆菌发酵产生乳酸并不断积累，抑制了其它细菌的生长。细菌群落结构变化与有机酸含量相关性显示（图3），乳酸杆菌属细菌丰度与系统中大多数其他细菌丰度呈负相关，特别是芽孢杆菌属属细菌丰度，且两者对其他菌的丰度影响正好相反。

此外，乳酸含量从41～33 h变化不明显，表明这个阶段乳酸杆菌的生长受到抑制，从33～10 h，乳酸含量逐渐变大，表明乳酸杆菌处于生长旺盛并大量产生乳酸、乙酸等有机酸，而10～2 h，乳酸含量大幅度上升，表明此阶段是乳酸杆菌大量产生乳酸时期（见图4）。

2.2.4  浸泡时间与细菌群落结构变化的关系

根据各样品中细菌物种组成和丰度，在属水平（丰度前50的属）作聚类分析热图（图5），该12个样品6个时间大致可分为三组：即浸泡2和10 h时的L7.2，L2.2，L2.10和L7.10为第一组，18 h和26 h的 L2.18，L7.18，L.26和 L7.26為第二组， 33h和41 h的L2.33，L7.41，L2.41和L7.33为第三组。这与PCA作图的结果相似（图6），表明物种多样性随浸泡时间发生变化，并在一段时间内相对保持稳定。

3  结 论

玉米浸泡过程是微生物生长、繁殖，代谢并产生活性物质作用于玉米籽粒的生物化学变化过程。采用逆流浸泡工艺，前期浸泡液中的SO2浓度比较低，利于乳酸菌发酵产生大量乳酸。同时乳酸作用于玉米胚乳细胞壁，使其形成一系列的洞或坑，便于浸泡水的进入并促进可溶物溶出。因此，浸泡前期（2～18 h），浸泡液的营养也比较丰富，乳酸杆菌生长旺盛，丰度高，发酵产生乳酸多。

随着浸泡时间延长，SO2浓度升高，乳酸杆菌生长受到抑制，芽孢杆菌属丰度增加，表明芽孢杆菌属更耐SO2。因此，在玉米浸泡24 h时，外加一定比例产乳酸的芽孢杆菌C15，该菌属芽孢杆菌属，可发酵产乳酸，从而促使玉米浸泡后期继续发酵产生乳酸。因此推测，这可能是33～41 h期间，浸泡液中乳酸含量维持一定浓度的原因。乳酸的形成，加速玉米中蛋白质的膨胀和软化，同时又维持了浸泡液中的Ca2+、Mg2+等金属离子的浓度，促进SO2与玉米蛋白的结合，从而减少了硫磺的使用。此外，研究表明，许多芽孢杆菌还会分泌一些蛋白酶[7]，这有利于降解玉米中的蛋白质，从而便于淀粉释出。

通过本文系统研究逆流浸泡过程玉米浆中微生物群落结构及其体系中有机酸和pH变化，全面了解工艺微生物与微生物间、微生物与化合物间相互作用，为玉米浸泡机理研究奠定基础，同时为工艺改进与优化提供理论指导。

参考文献：

[1]邱红星，张大力，修琳，郑明珠，刘景圣. 玉米淀粉湿法生产工艺研究[J]. 食品科技，2015，40（12）：136-139.

[2]Yang P.， Eckhoff S. R. Reducing steep time by adding lactic acid during countercurrent steeping of corn with different initial moisture contents[J]. Cereal Chemistry， 2000， 77（5）： 529-534.

[3]姜秀娟，吴威. 乳酸对玉米淀粉生产中浸泡效果的影响[J]. 产业与科技论坛， 2012（24）.

[4]丛泽峰，王宏龄，张敬军，等. 嗜热乳酸发酵法改进玉米浸泡工艺的研究[J]. 广州化工， 2015（19）.

[5]赵寿经，黄丽，钱延春，等. 嗜热乳酸菌的筛选及其在玉米淀粉湿法生产浸泡工艺中的应用[J]. 食品与发酵工业， 2008， 34（1）.

[6]贾铮，肖志明，李兰，樊霞.基于离子排斥色谱的饲料酸化剂中多种有机酸同步检测[J].农业工程学报，2016，32（12）：303-308.

[7]曹煜成， 李卓佳， 文国樑， 等. 芽孢桿菌胞外产物的研究进展[J]. 广东海洋大学学报， 2005， 25（6）：97-100.