应用磁共振T2弛豫自旋标记技术研究多巴胺D4受体-616位点单核苷酸多态性对原发性夜间遗尿症患儿脑氧代谢的影响

肖珊珊，黄明珠，张 旭，侯 阳，于 兵

（中国医科大学附属盛京医院放射科，辽宁 沈阳 110004）

原发性夜间遗尿症（Primary nocturnal enuresis，PNE）在5岁以上的儿童中发病率高达15%[1]，给患儿带来长期持续性的心理创伤，严重影响患儿的身心发育和生活质量。近年来，针对PNE的家系研究表明，遗传因素在PNE的发病中起着重要作用[2]。我们的研究发现多巴胺受体D4基因（Dopamine receptor D4，DRD4）启动子区多态性位点-616C/G（rs747302）单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）可能与PNE的发病有相关性[3]，但是rs747302基因型与PNE患儿脑氧摄取的相关性研究，截至目前未见报道。本研究拟应用T2弛豫自旋标记（T2-relaxation-under-spin-tagging，TRUST）技术[4]，结合DRD4-616C/G基因型检测，探索rs74-7302基因型对PNE患儿脑氧摄取率（Oxygen extraction fraction，OEF）以及脑氧代谢率（Cerebral metabolic rate of oxygen，CMRO2）[5]的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究选取2016年2月—2017年12月我院就诊的60例PNE患儿，及60例在年龄、性别、受教育程度方面与PNE患儿组匹配的对照组正常儿童。本研究计划获得我院伦理委员会许可（批准号2013PS24K）并在其监督下进行，所有参加研究儿童的家属或者其法定监护人签署知情同意书后参与研究。

入组PNE患儿遗尿症状符合国际儿童排尿节制学会（ICCS）诊断标准：每周夜尿≥3次，持续6月以上，日间能够控制排尿，而入睡后无法自主控制排尿，排除泌尿系统器质性疾病[6]。所有参加研究儿童智商（IQ）＞85；无神经及精神疾病病史；无睡眠呼吸异常病史；无服用任何典型或非典型精神活性药物史。

1.2 数据采集

1.2.1 DRD4-616C/G基因型分析

全体受试儿童采集外周静脉血5 mL，采用EDTA抗凝，提取基因组DNA操作使用Biomiga公司生产的基因组DNA提取试剂盒（EZgene TM Blood gDNA Miniprep Kit，Biomiga Inc.，San Diego，CA，USA）。使用ABI 9700 PCR扩增仪（Perkin-Elmer，Norwalk，CT，USA），采用等位基因特异性扩增技术检测DRD4基因上游5’端启动子区-616 C/G多态性，基因扩增引物分别采用F：GAACCTACCCCGGCCTGTCGT、R：AGACGGGAATGAAGCGAGGTGG、C specific：TGGTCGCGGGGGCTGAGC、G specific：CCCCCCMGCAGCCTCTGGYC及其退火温度均为69℃。PCR扩增C特异性产物片段长度415 bp，G特异性产物片段长度267bp，共有产物片段长度645bp。因为人群中CC基因型的频率很低，因而将CC和CG基因型受试儿童合并为C等位基因携带组（C组），将G纯合子（GG）受试儿童定为G组进行深入统计分析。

1.2.2 磁共振扫描数据处理

受试儿童脉搏血氧仪测定动脉血氧饱和度（SPO2）后，立即应用Philips Ingenia 3.0T超导型磁共振扫描系统及16通道SENSE头线圈进行MRI扫描。应用TRUST序列测算被试儿童的静息态OEF，参数如下：TR 1 978 ms，eTE 1，40，80，160 ms，FOV：220mm，矩阵：64×64，层数：1层，轴向层厚：5mm，扫描层面位于窦汇上方20 mm，平行于前后联合连线（AC-PC），扫描时间72 s。

采用霍普金斯大学医学院放射科陆汉璋教授团队撰写，基于Matlab平台运行的软件包，对TRUST图像进行后处理，首先对数据进行运动校正，然后对标记图像和未标记图像进行配对相减以获得上矢状窦内的血液信号。之后对不同eTE的上矢状窦内的血液信号进行指数拟合，换算出T2，R2（1/T2）以及R2的95%可信区间（图1）。如果受试者R2的95%可信区间＞10（说明原始数据受严重干扰，通常是头动所致，所以R2计算结果不可信），则排除该患者的数据。之后，根据陆汉璋教授的血氧含量与T2的换算方法，得出静脉血氧含量Yν[7]。根据公式OEF=（SPO2-Yν）/SPO2计算所有被试儿童的OEF。

相差法扫描来测算脑平均血流量（CBF）。具体步骤如下：首先通过3D时间飞跃法（TOF）颈部MRA扫描定位双侧颈内动脉和椎动脉；之后分别垂直上述4支血管进行相位对比法（PC）扫描，扫描层数为1层，像素大小=0.5 mm×0.5 mm×5 mm；FOV=200 mm×200 mm×5 mm；最大流速=40 cm/s；每支血管扫描时间15.2 s。

应用陆汉璋教授编写的PC法扫描图像后处理程序，对相位图进行后处理，手工划定所扫描的颈部血管作为感兴趣区，计算颈部血管的血流速度及血管截面积，根据4支颈部血管的血流速度及血管截面积，计算全脑总血流量。应用VBM8软件包，根据3D T1WI图像，计算脑实质体积（灰质及白质）；根据Herscovitch的研究结果，设定脑实质平均密度1.06。最后根据全脑总血流量，脑实质体积及脑实质密度，计算CBF（图1）。

得出CBFmean和Yν之后，根据菲克原理（Fick principle）计 算CMRO2：CMRO2=CBF×（Yα-Yν）×Hct。Hct：红细胞比容。

1.3 统计学分析

以分组（PNE/正常对照）和基因型（C/G）作为可能的影响因素，将年龄、接受教育时间和IQ作为协变量，对CBF，Yν及OEF数据进行协方差分析，计算分组及基因型这两个影响因素的主效应及交互效应。如果交互效应显著，则进一步进行Post-Hoc检验，检验PNE和对照组各自组内不同基因型被试儿童SPO2，Yν或OEF的差异，采用Bonferroni法对Post-Hoc检验进行多重比较校正，以校正后P＜0.05作为具有显著性差异。

2 结果

4例PNE患儿以及2例正常对照组儿童R2的95%可信区间＞10，他们的基因型数据和影像数据均不被统计。列入统计的被试基因检测结果见表1，他们的基本情况（年龄、接受教育时间和IQ）见表2。

协方差分析发现Yν、OEF以及CMRO2分组×基因型交互效应显著（F1，110=6.513，P=0.012 1；F1，110=6.888，P＜0.001；F1，110=13.01，P＜0.001），Post-Hoc检验发现结果携带C等位基因的PNE患儿OEF以及CMRO2值显著低于G纯合子PNE患儿（t=-5.976，Padjusted＜0.001；t=-5.594，Padjusted＜0.001）；Yν显著高于G纯合子PNE患儿（t=5.863，Padjusted＜0.001），而不同基因型的正常对照组儿童之间无显著差异（图2，表3）。

表1 所有被试DRD4-616位点基因检测结果

表2 所有被试基本情况

3 讨论

表3 所有被试脑氧代谢情况

近几年发展起来的TRUST是一种有用的技术，通过测量静脉血中T2获得上矢状窦中静脉血氧含量的定量值，它对血氧的变化很敏感，并应用于各种生理及病理条件下。静脉氧含量与动脉氧含量和脑血流结合时可以估计重要的生理参数，例如氧摄取分数和氧的脑代谢率，反映组织活力和功能。TRUST技术测量Yν结果的可重复性已经被多中心大样本研究所验证[8]。

图1 TRUST扫描与图像后处理。图1a：TRUST的扫描定位。图1b：TRUST数据后处理以后得到的上矢状窦血液信号。图1c：不同eTE的上矢状窦内的血液信号进行指数拟合。图1d：采用相位对比法（PC）进行双侧颈内动脉和椎动脉扫描。Figure 1.TRUST MRI scan and image post-processing.Figure 1a：The imaging slice of the TRUST MRI scan.Figure 1b：The blood signal in the superior sagittal sinus after the TRUST data post-processing.Figure 1c：Monoexponential fitting of blood signal in the superior sagittal sinus as a function of effective echo time(eTE)results in T2estimation.Figure 1d：Bilateral internal carotid artery and vertebral artery scan by phase-contrast MRI method.

图2 DRD4-616-C/G SNP对PNE患儿脑氧代谢的影响。图2a：DRD4-616-C/G SNP对PNE患儿Yν的影响。图2b：DRD4-616-C/G SNP对PNE患儿OEF的影响。图2c：DRD4-616-C/G SNP对PNE患儿CBF的影响。图2d：DRD4-616-C/G SNP对PNE患儿CMRO2的影响。Figure 2.The effect of DRD4-616-C/G SNP on brain oxygen metabolism in children with PNE.Figure 2a：The effect of DRD4-616-C/G SNP on Yνin children with PNE.Figure 2b：The effect of DRD4-616-C/G SNP on OEF in children with PNE.Figure 2c：The effect of DRD4-616-C/G SNP on CBF in children with PNE.Figure 2d：The effect of DRD4-616-C/G SNP on CMRO2in children with PNE.

我们的研究发现DRD4-616C等位基因携带的PNE患儿OEF和CMRO2都显著升高，提示这些儿童氧耗量升高，而且相对缺氧。我们推测：DRD4启动子区基因多态性影响了DRD4蛋白表达，进而影响DRD4蛋白的数量与功能[9]，进而影响PNE患儿脑发育过程中对无效及低效突触连接的修剪[10-11]，这些冗余突触致使C等位基因携带的PNE患儿脑氧耗量偏高及相对缺氧。而缺氧导致了PNE患儿在睡眠期间唤醒阈升高[12]。致使PNE患儿在睡眠期间对膀胱充盈的信号不能产生有效的觉醒反应，从而导致遗尿。

我们的研究同时发现DRD4-616C/G SNP仅仅影响了PNE患儿脑氧代谢。对正常对照组儿童没有影响，这可能是由于突触修剪受多种神经递质和神经受体影响，虽然正常儿童中C等位基因携带者也存在DRD4蛋白的异常，但可能被别的神经递质所代偿；而PNE患儿中的C等位基因携带者却缺乏相应代偿机制，所以表现出了脑氧耗量以及缺氧。

我们的研究还存在较多局限性，首先，由于样本数目有限，而且C等位基因纯合子的频率很低，因而我们在研究中将CC和CG合并为一组，这样合并可能造成一定程度的遗传效应混淆。其次，我们的脑氧代谢数据是在患儿静息状态下采集的，静息状态下发现的CBF异常，是否在睡眠状态下依然存在，还需要应用同步EEG-PET或者EEG-MRI采集技术，深入进行睡眠状态下的影像研究。再次，本研究测得的PNE患儿脑氧代谢参数只是全脑范围的平均值，而无法精确地对不同脑区的脑氧代谢状况进行详细评估。为了深入研究PNE患儿的脑氧代谢异常，我们还需要结合睡眠监测及随访，进行深入、大样本的队列研究。