冠心II号对抑郁联合高脂大鼠行为及海马BDNF的影响❋

郑 飞，张学娅，俸一然，饶宇东，许东云，张 颖

(昆明医科大学第一附属医院，昆明 650032)

现代社会冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease，CHD)合并抑郁症的患者比例逐年增加[1]。文献报道，住院的CHD患者有17%～27%合并有抑郁症[2]，CHD合并抑郁症的患者心脑血管疾病死亡率较一般CHD患者增加1.6倍[3]。这契合了胡大一教授“双心医学”中提出的“双心”患者状况[4]，因此同时治疗CHD和抑郁症具有重要意义。

中医“脑心同治”理论指出，对于相同病因病机的心脑疾病宜选用相同的治疗方药，可取得同样的疗效。本课题认为，抑郁症(郁证)和CHD(胸痹)的中医共同病机为气滞血瘀。冠心II号(guanxin II，GXII)作为活血化瘀疗法的代表方药，除具备CHD治疗作用外[5]，可能具备抗抑郁作用。本实验以GXII为研究工具，通过慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)联合孤养方法和高脂饮食诱导大鼠抑郁高脂模型，探讨GXII除具备治疗CHD作用外，是否具备抗抑郁样作用及其可能机制。

1 材料

1.1 动物

Wistar雄性SPF级大鼠98只，体质量(180～220)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(许可证号SCXK(湘)2013-0004)，饲养于昆明医科大学动物部动物房。

1.2 药物及饲料

盐酸氟西汀，Patheon France 公司(礼来苏州制药有限公司分装，批号0713B)；维生素D3注射液，上海通用药业股份有限公司(批号121113)；GXII汤剂，中药材由昆明市中医院中药房提供，昆明市中医院中药制剂室制备，生药浓度1.0 g/ml。高脂大鼠饲料按3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料的比例制备，北京博泰宏达生物技术有限公司。

1.3 试剂

RIPA裂解液，上海碧云天生物技术有限公司(货号P0013B)；BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司(货号P0012S)；ECL显色液，Millipore公司(货号WBKLS0500)；脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)抗体，Abmart公司(货号AB108319)；HRP标记通用型二抗，Abmart公司(CST公司分装，货号7074S)；β-actin抗体，Proteintech公司(货号20536-1-AP)。

1.4 仪器

SMART3.0动物行为学视频采集与分析系统，Panlab公司；Any-maze动物行为分析系统，Stoelting公司。低温离心机，Hitachi公司(型号CF-16RX)；紫外可见分光光度计，Hitachi公司(型号U-3010)；酶标仪，Molecular公司(型号PECTRA MAX190)；凝胶成像仪，BIO-RAD公司(型号Chemical xps+)；HE全自动染色机，MICROM公司(型号HMS760X)；显微镜，Olympus Corporation公司(型号BX43)；显微照相机，Canon公司(型号EOS600D)。

2 方法

2.1 分组

大鼠实验室适应性喂养1周后开始分组实验，将大鼠按随机数字表法分为7组各14只，分别为抑郁氟西汀组(depress fuxio DF组)、抑郁GXII组、抑郁模型组、抑郁高脂氟西汀组、抑郁高脂GXII组、抑郁高脂模型组和空白对照组。

2.2 动物模型建立

抑郁氟西汀组、抑郁GXII组和抑郁模型组：大鼠CUMS联合孤养方法造模，给予正常饮食；抑郁高脂氟西汀组、抑郁高脂GXII组和抑郁高脂模型组：大鼠CUMS联合孤养方法造模，同时给予高脂饮食，并在给予高脂饲料前一次性腹腔注射维生素D3注射液(60万IU/kg)；空白对照组：无特殊处理，给予正常饮食，各组造模均连续8周。

2.3 给药方法

抑郁氟西汀组、抑郁高脂氟西汀组给予盐酸氟西汀(3.5 mg/kg)混悬液灌胃，抑郁GXII组、抑郁高脂GXII组给予GXII(2.5 g/kg)中药汤剂灌胃，抑郁模型组、抑郁高脂模型组、空白对照组给予生理盐水(2.5 g/kg)灌胃，各组给药均连续15 d。

2.4 旷场实验

测定时间为大鼠末次给药24 h后，采用SMART3.0动物行为学视频采集与分析系统。敞箱为方形100×100×40 cm大小，由木板制成，内壁及底面均为黑色。将单只大鼠放于清洁敞箱内，记录5 min内大鼠活动总距离。每天每只大鼠仅测量1次，1只大鼠测量后待彻底清洁敞箱后再进行下只大鼠测量。每只大鼠连续测量7 d，取最后3 d均值进行统计分析。

2.5 强迫游泳实验

测定时间为大鼠末次给药24 h后，采用Any-maze动物行为分析系统。水箱为圆形100×50 cm大小，由塑料制成，内壁及底面均为黑色。将单只大鼠放于20 cm水深的水箱内，使其后肢不能触及底部形成支撑。实验包括两阶段，大鼠先预游3 min，再记录之后5 min内大鼠不动时间。每天每只大鼠仅测量1次，1只大鼠测量后更换清洁水以防上只大鼠气味干扰，再进行下只大鼠测量。每只大鼠连续测量7 d，取最后3 d均值进行统计分析。

2.6 Western blot法测定海马组织BDNF含量

大鼠末次行为学测定24 h后，待大鼠麻醉迅速心脏取血，脱颈处死后将大鼠置于冰台上，分离取出海马组织。每100 mg海马组织中加入500 μL的RIPA裂解液(含30 ul蛋白酶抑制剂)，用无菌的眼科剪充分剪碎组织后，冰浴环境下用超声细胞破碎仪匀浆20 s，冰浴上静置裂解20 min；4 ℃ 12000 r/min离心10 min，收集上清液。使用Western blot法测定大鼠海马组织BDNF含量。

2.7 胸主动脉及大脑中动脉HE染色

大鼠取出海马组织后，迅速分离出胸主动脉及大脑中动脉，置于4%多聚甲醛溶液中固定，采用HE染色法处理，显微镜摄片。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 胸主动脉及大脑中动脉病理学改变

图1、2显示，HE染色及显微镜摄片显示，空白对照组胸主动脉及大脑中动脉血管壁结构未见明显异常；抑郁高脂氟西汀组和抑郁高脂模型组可见病理性内膜中膜增厚，少许脂质沉积，外膜部分细胞空泡变性，未见明显脂质斑块；抑郁高脂GXII组可见内膜中膜少许增厚，提示GXII对心脑动脉可能具有抗动脉粥样硬化的保护作用。

3.2 旷场实验和强迫游泳实验结果

表1显示，与空白对照组比较，抑郁模型组、抑郁高脂模型组的大鼠旷场实验活动总距离缩短及强迫游泳不动时间增加(P<0.05)，提示抑郁造模成功。与抑郁模型组比较，抑郁氟西汀组、抑郁GXII组的大鼠旷场实验活动总距离增加及强迫游泳不动时间缩短(P<0.05)；与抑郁高脂模型组比较，抑郁高脂氟西汀组、抑郁高脂GXII组的旷场实验活动总距离增加及强迫游泳不动时间缩短(P<0.01，P<0.05)，提示盐酸氟西汀及GXII具有抗抑郁样作用。抑郁氟西汀组和抑郁GXII组、抑郁高脂氟西汀组和抑郁高脂GXII组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示盐酸氟西汀和GXII抗抑郁作用疗效比较差异无统计学意义。

注：A.空白对照组；B.抑郁高脂模型组；C.抑郁高脂氟西汀组；D.抑郁高脂GXII组图1 各组大鼠胸主动脉病理形态学变化比较(HE ×400)

注：A.空白对照组；B.抑郁高脂模型组；C.抑郁高脂氟西汀组；D.抑郁高脂GXII组图2 各组大鼠大脑中动脉病理形态学变化比较(HE ×400)

表1 冠心II号方对大鼠旷场实验、强迫游泳实验和BDNF表达影响比较

注：与空白对照组比较：#P<0.05，##P<0.01；与抑郁模型组比较：+P<0.05，++P<0.01；与抑郁高脂模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

3.3 海马BDNF含量变化

表1显示，与空白对照组比较，抑郁模型组、抑郁高脂模型组的海马BDNF含量减少(P<0.01)，提示抑郁造模成功。与抑郁模型组比较，抑郁氟西汀组、抑郁GXII组的海马BDNF含量增加(P<0.01，P<0.05)；与抑郁高脂模型组比较，抑郁高脂氟西汀组、抑郁高脂GXII组的海马BDNF含量增加(P<0.01，P<0.05)，提示盐酸氟西汀及GXII具有上调海马BDNF表达的作用。抑郁氟西汀组和抑郁GXII组、抑郁高脂氟西汀组和抑郁高脂GXII组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示盐酸氟西汀和GXII抗抑郁作用疗效比较差异无统计学意义。

4 讨论

早在东汉时期，著名医家华佗在《青囊秘录》中说：“善医者，必先医其心，而后医其身，其次则医其病。”近些年“双心医学”的发展[4]，使医务工作者对身心疾病的认识进一步提高，CHD合并抑郁症患者的治疗得到医务界广泛关注。这种“双心医学”的模式体现，是“以人为本”即从“治病”到“治病人”。

GXII是郭士魁大师、陈可冀院士于上个世纪60年代提出的中药复方，具有活血化瘀之功效，用于治疗CHD[6]。此方由中药丹参、川芍、赤芍、红花和降香5味传统中药按照2∶1∶1∶1∶1比例组成，现有中成药制剂，包括精制冠心片、精制冠心颗粒、精制冠心软胶囊和胶囊等，被收录于《中华人民共和国药典》。国内研究证明，GXII对CHD具有确切的临床治疗效果[5]，可改善血液流变性及微循环，抑制血小板积聚，预防血栓形成，降血脂和抗动脉粥样硬化，提高耐缺氧能力，抗心肌梗死、心肌细胞凋亡、抗氧化、增加冠脉血流量、抗炎等诸多作用[5-9]。

本研究大鼠胸主动脉及大脑中动脉病理学改变表明，抑郁高脂GXII组能改善胸主动脉及大脑中动脉病理改变，提示GXII对心脑动脉可能具有抗动脉粥样硬化的保护作用。该结论与上述GXII心脏保护作用相一致[5-9]。本研究大鼠行为学检测表明，GXII能增加旷场实验活动总距离，缩短强迫游泳不动时间，提示GXII具有抗抑郁样作用。

神经营养学说是目前抑郁症机制研究的重要学说之一。BDNF在神经细胞的再生、存活、分化、功能维持和突触的传递、重塑性方面发挥着重要作用[10-11]。文献报道，BDNF与大脑记忆和学习功能密切相关，其机制可能与BDNF广泛分布于海马及皮层组织有关[12]。此外，BDNF表达与CHD也相关，研究表明CHD患者血清中BDNF水平升高[13]。BDNF与血管内皮细胞存活、增殖、移行密切相关，并在动脉粥样硬化、缺血性心肌病等疾病中表达改变。BDNF表达缺陷会导致血管内皮细胞间信号传导异常及心肌血管内皮细胞凋亡[14]。这些研究提示，BDNF可能在抗抑郁及心脏保护中扮演重要角色。本研究大鼠海马BDNF表达测定表明，GXII可提高CUMS联合高脂大鼠模型海马组织BDNF表达水平，提示GXII具有抗心脑动脉粥样硬化及抗抑郁样作用，其作用可能与上调海马组织BDNF表达相关。

中医学认为，“胸痹心痛”与“郁病”二者之间有联系。中医整体观认为，形是人的形体，神是人的精神意识思维活动，神形合二为一构建人体。CHD合并心境低落乃是情志与脏腑功能活动失调，即“形神失和”。中医藏象学说认为，脑为元神之府，心脑共主神明，即心脑血脉相通，共为神明之府，共同主宰人体生命活动，产生意识思维并支配其相应行为。《黄帝内经》提出心主血脉，心藏神。一方面，心脏搏动推动血液流注全身，濡养人体五脏六腑形体官窍；另一方面，心为君主之官，神明出焉，即心主宰人体精神意识思维活动。因心脑共为神明之府，又有血脉相通，故“一处神明伤，则两处俱伤”。脑之神明伤可累及于心，心之神明伤可累及于脑。中医病因病机的认识，中医学对“胸痹心痛”的认识是因年老体虚、饮食不当、情志失调、寒邪内蕴等多种原因导致心脉痹阻、气滞血瘀，其病位在心，病机为气滞血瘀。而郁病多由情志内伤引起，其病机主要以气机郁滞为主常兼血瘀，二者共同的病机为“气滞血瘀”。王阶等[3]对CHD合并抑郁症进行了相关中医证候特征研究，并提出CHD合并抑郁症的中医证候要素特点为血瘀、气虚、肝郁、气滞、痰浊等，其中“气滞血瘀”被提到重要地位。综上，“心脑共主神明”学说及“胸痹心痛”“郁病”二者共同的病机皆为气滞血瘀，这些构建了“脑心同治”的中医学治疗原则，即CHD合并抑郁症有共同的病理变化基础，因此“行气活血”是中医治疗“胸痹心痛”与“郁病”共同的指导原则[15]。GXII作为活血化瘀疗法的代表方药，一方面对“胸痹心痛”患者通过活血化瘀、通络止痛以达成祛瘀通脉、行气止痛之效，另一方面对“郁病”患者通过活血化瘀、理气解郁以达成行气开郁之效。心脑血脉相通共为神明之府，运用活血化瘀经典中药复方GXII同时治疗“胸痹心痛”及“郁病”，体现了中医学“脑心同治”的治疗原则。

综上所述，本研究发现GXII具备抗心脑动脉粥样硬化样保护作用及抗抑郁样作用，其作用机制可能与上调海马组织BDNF表达相关。本研究体现了中医学“脑心同治”，可能为治疗抑郁症合并CHD患者提供临床用药参考。但其具体作用通路、作用途径仍不明确，尚需今后进一步的深入研究。