ROS对FOXO蛋白激活和基因表达的影响

吕舸，周吉芳，杨杰，丁启龙

(中国药科大学医学基础实验教学中心，江苏 南京 211198)

“Fork head”最初在果蝇体内发现，作为一种潜在的转录因子，随后证明其有翼状DNA结合区域，此时意识到它可能是已发现的其他转录调节因子，如HNF-3A，即现在的转录因子叉头框蛋白A1(FOXA1)[1]。它存在于所有的真核生物中，在哺乳动物中叉头框转录因子家族O亚族(FOXO家族)包括4个成员：FOXO1、FOXO3、FOXO4、FOXO6，在体内广泛表达，FOXO6最晚被发现，在结构和功能上和其他3个差别较大[2]。FOXO家族均有一个由110个氨基酸构成的DNA结合结构域，结合到靶基因的TTGTTTAC序列，从而发挥作用，包括调节糖异生、细胞周期停滞、分化、DNA修复，自噬和细胞凋亡等。FOXO家族不同成员有不同的调节作用，FOXO1主要调节葡萄糖稳态，FOXO3是无脊椎动物、小鼠和人类中重要的调节寿命的因子，也和氧化应激反应和肿瘤抑制活性密切相关[3]。

机体氧化应激状态下会产生过多的活性氧簇(ROS)，ROS是电子轨道最外层有未配对电子的活性基团，包括自由基和一些强活性的分子。活性氧过多产生会对机体产生危害，最初被认为是有毒的，是有氧代谢的产物。但现在发现ROS可以作为信号传导的“第二信使”，在细胞信号通路中扮演重要角色，特别是在应激反应下，体内ROS会产生变化，对氧化应激进行调节[4]。

FOXO是细胞内应激应答的重要调节因子，刺激编码抗氧化蛋白基因的表达，对抗细胞内的氧化反应[5]。另一方面，ROS也能在多种水平调节FOXO的活性，包括转录后修饰和转录修饰[6]。本文就ROS对FOXO活性和蛋白基因表达的调节进行综述。

1 ROS在FOXO转录后修饰中的作用

FOXO的活性受到多种转录后修饰和核质穿梭的控制，最近FOXO合成的转录后修饰调节已经成为了FOXO功能调节的一种新的方式。有证据表明FOXO转录后修饰的调节方式主要用于应答应激刺激，包括氧化应激[5]。FOXO是各种激酶的底物，能够被磷酸化、乙酰化、泛素化、糖基化和氧化等，这些修饰能够影响FOXO的活性，如FOXO的DNA结合、转录激活活性、亚基定位、以及和转录共调节因子结合。

1.1 ROS影响FOXO蛋白的磷酸化修饰 磷酸化是FOXO转录后修饰的一种重要形式，它能够影响FOXO的核质穿梭和DNA结合。引起FOXO磷酸化的主要是上游信号级联,最重要的一条信号通路起始于胰岛素受体和胰岛素样生长因子受体，通过作用于磷脂酰肌醇3′-激酶(PI3K)和丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)，引起FOXO的磷酸化失活以及出核[7]。ROS在胰岛素受体(InsR)和胰岛素样生长因子受体(IDF1-R)级联信号通路中能够作用于多个位点，从而影响FOXO的磷酸化，影响FOXO的活性。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)能够作用于胰岛素受体，使其去磷酸化和失活。PTP在其活性位点上有一个氧化敏感型半胱氨酸，能够被活性氧氧化，从而失活[8]。磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)通过催化磷酸肌醇的3′-去磷酸化来减弱PI3K信号传导，和PTP类似，PTEN也能够被活性氧灭活，PTEN暴露在H2O2中时，在其活性部位形成二硫键，从而失去活性[9]。Akt也能够被活性氧氧化，从而抑制其活性。AKt暴露在活性氧中能形成亚磺酰化Akt，与亲电子试剂反应，如与脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛(HNE)迈克尔加成为敏感的半胱氨酸残基，导致Akt抑制[10]。通常来说FOXO磷酸化后都会出核，并失活，但FOXO6通过PI3K-AKt通路磷酸化后，虽然失活，但却仍在核内[11]。

1.2 ROS影响FOXO蛋白的乙酰化修饰 FOXO赖氨酸的乙酰化修饰能够影响FOXO的活性和稳定性，减弱FOXO的DNA结合和转录活性，还会使FOXO易受磷酸化和出核的影响，同时赖氨酸的乙酰化也能够稳定FOXO，使其免于相同位点的泛素化[12]。氧化应激造成的细胞内ROS水平增加，特别是H2O2，是FOXO乙酰化和泛素化的关键介质。CREB结合蛋白CBP和P300是组蛋白乙酰化酶的两个亚型，ROS介导FOXO乙酰化的分子机制已经被初步阐明，外源性加入的低浓度的(25 μmol·L-1)H2O2能够促进p300/CBP乙酰转移酶和FOXO4之间通过二硫键形成二聚体[13]，它们之间的连接通过FOXO4上的半胱氨酸残基C477介导。这种FOXO的半胱氨酸残基在人类和哺乳动物中都是高度保守的，因此氧化还原敏感的异二聚体，可能为H2O2诱导的FOXO乙酰化的机制。但是最近的研究发现，在FOXO3a上的半胱氨酸残基，并不和乙酰转移酶结合[14]。

2 ROS在FOXO基因转录调节中的作用

2.1 ROS影响miRNA对FOXO蛋白表达的调节 目前，在一些病理生理过程中许多miRNA已经被作为FOXO表达的调节因子，包括在抗原激活的TH淋巴细胞克隆扩增，老化期间造血干细胞(HSC)的维持，心脏肥大，和某些神经退行性疾病中，都有此调节过程。许多直接作用于FOXO mRNA的miRNA也与肿瘤促进，生长或转移有关：例如，在肺癌和黑色素瘤中miR-182靶向直接作用于FOXO3 mRNA[15];相同的FOXO3 mRNA也被miR-155靶向调控，促进胰腺癌中的氧化应激[16]。

经过初步研究发现，氧化应激能够抑制Janus激酶-信号转导与转录激活因子(JAK-STAT)信号通路被细胞因子的激活[17]，随后又发现，在氧化应激状态下，STAT5↑/miR-182↑/FOXO1↓信号通路，可以被快速转变为上调FOXO的表达(STAT5↓/miR-182↓/FOXO1↑)。将SK-N-MC人神经母细胞瘤细胞暴露于300 μmol·L-1的H2O2中，会使STAT灭活，10倍下调miR-182，最终使FOXO1蛋白水平增加4倍[18]。

2.2 ROS影响RNA结合蛋白对FOXO蛋白表达的调节 HuR是一种AU富含元件(ARE)结合调节蛋白，可特异性的结合靶RNA的ARE，参与细胞存活，细胞分裂，免疫应答，能够促进mRNA稳定，并作为翻译促进因子[19]。通常在细胞核内，感受应激刺激后(包括氧化应激)，转移到细胞质。细胞暴露于氧化应激环境中后，会使p38-MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)激活，之后直接或间接刺激HuR磷酸化，导致其与靶mRNA的结合和在细胞质中的积聚。HuR本身也是氧化还原的感受器，HuR为同源二聚体时得到全部活性。三个HuR RNA识别位点中的第一个半胱氨酸残基通过形成分子间二硫键促进同源二聚化[20]。因此氧化还原敏感的半胱氨酸，通过使HuR形成同源二聚体，应答氧化应激刺激。目前已在FOXO1 RNA的3′-UTR和内含子区域鉴定出HuR结合位点[21]，而在FOXO3 mRNA中仅发现内含子中的HuR结合位点。HuR在MDA-MB-231乳腺癌细胞中过表达能够稳定FOXO1mRNA，提高FOXO1的蛋白水平。在5-氟尿嘧啶(5-FU)的应激刺激下，会导致内源性HuR上调，最终导致细胞FOXO1水平增加。5-FU诱导的细胞凋亡几乎完全被同源siRNA介导的内源性HuR敲除所抑制，并在HuR-siRNA存在下通过异位FOXO1的过表达而重新发挥作用。 总之，这些数据表明，当暴露于应激刺激时，HuR介导FOXO1上调，从而诱导癌细胞凋亡。

第二个参与FOXO转录后修饰的RNA结合蛋白是Quaking(QKI)[22]。是mRNA剪切、转移、稳定和转录的调节因子，协助调节细胞分化和细胞周期，还起到肿瘤抑制的作用[23]。Galarneau和Richard[24]定义了QKI反应元件(QRE)的共有序列(NACUAAY-N1-20-UAAY)，并使用生物信息学分析预测了小鼠中1 400个以上QKI mRNA靶标。

在MCF- 7乳腺癌细胞中，FOXO1 mRNA的3′-UTR结合了miR-27a，miR-96、miR-182和QKI蛋白、HuR蛋白[25]。用反义抑制剂靶向抑制这些miRNA和敲除QKI，它们对内源性FOXO1表达影响相同，都导致FOXO1 mRNA和蛋白质水平的上调。对比HuR在FOXO1的mRNA 3′-UTR内的结合位点ARE和QKI的结合位点QRE，发现在3′-UTR区域内，第二个ARE与第三个QRE重叠。这种结合位点的排列提示了两种调节蛋白对FOXO1转录调节相互排斥的可能性。对MDA-MB-231乳腺癌细胞的5-FU处理导致FOXO1上调，同时上调HuR和下调QKI。 由此我们可以推测FOXO1的转录后调节涉及特定miRNA，HuR和QKI之间的功能性相互作用，以这种方式，FOXO1蛋白可以通过这些相互作用在转录后上调，以应对各种应激刺激，包括氧化应激。

未来的实验需要确定这两种影响是否是独立的，即在一个实验中同时miRNA抑制和QKI敲除是否具有加性效应并导致FOXO1上调增多。 另外，miRNA和QKI的作用可以相互关联，然后预期仅针对一种因子(例如靶向miRNA)的治疗也会阻止另一种因子(例如QKI)与3′-UTR的结合。

2.3 ROS影响p53对FOXO蛋白表达的调节 肿瘤抑制蛋白p53能够维持基因组完整性。为了调节细胞应激产生的DNA损伤，野生型p53协调了许多基因的转录，并通过靶基因的差异激活将细胞导向细胞周期停滞、衰老或凋亡，防止DNA继续受损。最近有研究发现，肿瘤抑制因子p53是FOXO3a的上游调节因子。顺铂和银杏叶的药理学研究表明，化疗药物诱导的ROS增加了癌基因C-myc[26],升高的C-myc水平抑制p21Cip1的p53-反式激活，抑制细胞周期停滞，但不影响促凋亡基因PUMA的p53-反式激活，从而导致细胞凋亡激活。

除了ROS和p53通过信号传导网络之间的相互作用，ROS的直接作用也可能影响p53的激活。p53的稳定性和活性受到多种共价翻译后修饰的影响，如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等。p53的磷酸化，甲基化和乙酰化通常导致其稳定，积累和活化。在这些翻译后修饰中，ROS与p53介导的磷酸化有关，通过蛋白激酶，包括p38α-MAPK，共济失调毛细血管扩张症突变蛋白(ATM)和细胞外信号调节激酶(ERK)。然而，这些蛋白激酶的激活不一定是ROS特异性的，这些蛋白激酶是响应DNA损伤的信号传导途径的常见下游效应物。由于存在含有氧化还原敏感型的半胱氨酸(Cys)，p53本身具有氧化还原活性。在p53 DNA结合域中存在两个半胱氨酸簇，其对于p53与其共有序列的特异性结合是必需的。Cys 124、135、141、182和277位于p53的DNA结合域，构成了氧化还原调制的结构平台。

从理论上讲，蛋白质中有多种可能的氧化巯基结构，包括磺酸(-SOH)，二硫化物(-S-S-)，次磺酰胺(-SNR1R2)，亚磺酸(-SO2H)和磺酸(-SO3H)。已经观察到用氧化剂处理p53能够取消它的DNA结合活性。最近的研究确定了p53氧化的作用位点，发现在氧化剂处理后GSH会与Cys124、Cys124结合，连接通过二硫键与p53连接，降低p53的DNA结合活性，该过程可被抗氧化剂逆转[27]。

3 ROS对FOXO的调节与FOXO转录共调节因子

转录共激活因子PGC-1α是碳水化合物和脂质代谢以及线粒体生物合成和功能的上游调节因子，并且能够在不同的系统里调节FOXO的活性[28]。PGC-1α通过与FOXO1a共同作用，正向调节空腹诱导的肝脏糖异生。相似的，FOXO1a诱导的肝细胞中硒蛋白P(SelP)的表达也能够通过与PGC-1α共同作用而加强[29]。在内皮细胞和骨骼肌细胞中，PGC-1α也可以与FOXO3a共同作用调节抗氧化蛋白的表达[30]。

在肾脏中，高脂饮食引起的肾脏脂毒性与胰岛素抵抗和血脂异常有关，可能是由于FOXO3a和PGC-1α的下调和氧化应激增加。给药自由基清除剂TEMPOL,通过调节PI3K-Akt-FOXO信号传导来预防肾损伤[30]，改善了高脂饮食诱导的肾损伤，这可能是由于FOXO3a和PGC-1α的上调导致了对氧化应激和脂肪细胞凋亡的保护作用[31]。转录辅因子和赖氨酸脱甲基酶(KDM)通过与FOXO共同作用能够诱导抗氧化防护基因的表达，这表明该复合物的主要作用是维持氧化应激抗性基因的基础表达，而不是它们对外源氧化应激反应的影响[32]。该结果进一步表明，FOXO进入不同的染色质环境和核微环境可能依赖于不同的辅助因子。

4 总结与展望

虽然氧化应激可能导致许多疾病的发生，但低生理浓度的ROS，特别是过氧化氢，已成为激素和生长因子介导的细胞代谢控制中不可缺少的信号分子。FOXO的活性和细胞氧化还原状态本质上是相互联系的，FOXO充当细胞氧化还原传感器，通过磷酸化，乙酰化和泛素化在翻译后进行修饰，对氧化应激反应，影响FOXO细胞质核穿梭、FOXO稳定，最终影响FOXO靶基因的转录。ROS也能够在转录水平影响FOXO的表达，miRNA和p53是FOXO的上游信号分子，ROS能够间接通过控制他们的活性来调节FOXO的表达。HuR和QKI是RNA结合蛋白，能够与FOXO的RNA结合控制FOXO的转录，在氧化应激状态下，HuR和QKI相互作用，使FOXO蛋白在转录后上调，以应对氧化应激刺激。

此外，FOXO还能以氧化还原敏感的方式与其他蛋白(包括共调节因子和抗氧化酶)相互作用，并且有一些证据表明FOXO基因表达本身具有氧化还原敏感性调节作用。另一方面，一些FOXO靶基因是抗氧化酶，它们通过催化歧化和减少超氧化物和过氧化氢来影响细胞内和细胞外氧化还原状态。 FOXO介导的基因表达的最终结果影响氧化损伤后的细胞命运，诱导凋亡细胞死亡或细胞周期停滞和随后的修复过程。在生理条件下，FOXOs参与细胞分化，能量代谢，调节营养稳态,在与氧化应激相关的一些病理条件下FOXO过度活化可能增加2型糖尿病的代谢紊乱或癌症。所以需要继续深入研究ROS对FOXO活性和表达的影响，从而能够进一步明确疾病的发病机制，为研发新的药物提供思路。