圈养大熊猫乳汁香气成分探究

鲜义坤1,李 果,李裕冬1,王承东,熊铁一1,张贵权

(1.四川省自然资源科学研究院,四川 成都610041;2.大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草业局重点实验室，四川 卧龙 623006；3.中国大熊猫保护研究中心,四川 卧龙623006)

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)母乳不但具有营养价值和免疫功效,而且通过气味方式传递某些信息,如引诱幼仔吸食等。目前，对圈养大熊猫乳汁的营养成分[1-9]和活性物质[10-12]已有部分研究,但挥发性有机成分和香气成分国内外尚未见报道。

顶空(HS)—固相微萃取(SPME)技术始创于20世纪90年代,是一种分析挥发性化合物的前处理技术;气相色谱(GC)—质谱(MS)联用技术可对样品中的挥发性组分进行分离和鉴定。随着这两项技术的日臻完善,HS-SPME结合GC-MS开辟了国内外分析未知混合型挥发性成分的崭新局面。由于具有操作简便、不加溶剂、用样量少、灵敏度高、检测高效、结果准确等特点,HS-SPME-GC-MS分析法现已广泛应用于食品、饲料、医药、化工、环保、探索生物奥秘、侦查案件等领域分析测定微量甚至痕量的挥发性有机物质(VOCs)。鉴于大熊猫乳汁极为珍贵,样品难以采集,本文在比较了多种分析测定方法的优缺点之后,结合具体实际情况,优选了当今主流的HS-SPME-GC-MS方法用于测试圈养大熊猫乳汁中的VOCs和香气成分。

部分学者曾用HS-SPME-GC-MS方法分析过羊乳和牛乳中的挥发性化合物[13-15]、猪乳中的风味物质[16,17],为本项研究提供了可参考的方法。测试大熊猫乳汁中的VOCs,再细究VOCs中的香气成分是在理论上探索大熊猫乳汁香气成因和乳源性化学信息素的简捷路径。本文旨在填补大熊猫乳汁香气成分方面的资料空白,为研制圈养大熊猫幼仔专用诱食剂提供原料选择的参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试动物

本文选择4只健康状况良好、泌乳机能正常的圈养大熊猫母兽(表1)作为研究对象。供试母兽饲养在中国大熊猫保护研究中心卧龙神树坪基地(简称“大熊猫中心”),日粮以竹秆为主,以竹叶、窝窝头、胡萝卜、苹果等为辅,自由采食和饮水,圈内随意活动,按照大熊猫中心既定的哺乳期饲养规程进行日常饲喂和管理。

表1 供试大熊猫母兽基本信息与乳汁样品采集日期

1.2 乳汁样品采集、运输与保存

由大熊猫中心富有经验的饲养员在大熊猫母兽非物理和非化学保定的状态下采用人工挤乳法采集乳汁样品。母兽产仔日期、人工采乳日期、采乳时母兽年龄与幼仔日龄、母兽呼名等基本信息见表1。乳样直接挤入已清洗干净并经湿热高温(≥121℃,20min)灭菌除味的离心管(≥10mL)中,旋紧管帽,再用无味的封口膜缠绕帽口与管颈结合处数圈确保密封,以防止乳样气味散失和串入其他气味;对乳样管进行标注、登记、装袋后尽快置于装有20kg干冰的纸箱中,密封,采用汽车运输。上述样品保存于四川省自然资源科学研究院种质室-80℃冰箱中备用。根据免疫球蛋白含量的测定结果,有关文献[11]认为圈养大熊猫产后5天内的乳汁才是真正意义上的初乳,5天后的乳汁应为常乳。由表1可知,本文所用乳样为产后10—56天的乳汁,属常乳。

1.3 HS-SPME方法

取10mL乳样置入20mL的顶空瓶中,加入3g NaCl(国产分析纯,成都市科龙化工试剂厂),用密封垫和铝盖迅速密封顶空瓶,震荡,以促进NaCl溶解;将已老化的萃取头(250℃下老化,SPME头和手动进样手柄均为美国Supelco公司出品)插入顶空瓶,推出萃取纤维头至离液面约1cm处;将顶空瓶和萃取头置于电热恒温水浴锅内,固定,60℃或70℃分别顶空萃取1—4h(表2),其间每隔0.5h晃动1次;缩回萃取纤维头,拔出后快速插入GC进样口,推出萃取头解吸。

表2 乳汁样品与香气成分的探寻方法

1.4 GC-MS联用分析

测试方法一:GC-MS联用仪为QP 2010Plus(日本岛津公司)。方法为:①GC条件。色谱柱为非极性石英毛细管柱(美国Agilent公司),型号为DB-5MS,规格30m×0.25mm×0.25μm,柱箱温度40℃,进样温度270℃,进样模式不分流,进样时间1min,载气为高纯氦气,流量控制模式压力49.5kPa,总流量16.0mL/min、柱流量1.0mL/min、线流量36.1cm/s,吹扫流量进样模式5.0mL/min,分流比10.0;程序升温模式的起始温度40℃,保持5min,以5℃/min速率升温至80℃,保持5min,再以10℃/min速率升温至280℃,保持15min。②MS条件。接口温度220℃,离子源温度200℃,电离方式为EI,电子能量70eV,质量扫描范围(m/z)23—500。③数据处理。主要利用GC-MS工作站软件和自带NIST标准谱库自动检索各组分质谱数据。定性检测需组分质谱图与标准谱图的匹配度≥80%,结合质谱裂解规律,同时参照保留时间推定乳汁中的VOCs。定量检测按峰面积归一化法仪器自动计算各组分的相对百分含量。

测试方法二:GC-MS联用仪为Agilent 7890B-5977B(美国Agilent公司)。方法为:①GC条件。色谱柱为强极性石英毛细管柱(美国Agilent公司),型号为HP-INNOWax,规格30m×0.25mm×0.25μm,进样口温度为250℃,载气为高纯氦气,柱流量0.80mL/min,进样模式为分流,分流比为5∶1;程序升温模式的起始温度45℃,保持2min,以5℃/min速率升温至120℃,再以10℃/min速率升温至200℃,最后以15℃/min速率升温至280℃,保持10min,解吸3min。②MS条件。传输线接口温度250℃,离子源温度230℃,离子源为EI,电子能量70eV,四极杆温度150℃,质量扫描范围20—450amu。③数据处理。将采集到的质谱图经GC-MS配套的计算机自动检索,初步鉴定成分物质,再与Wiley第11版谱库和NIST2014版+2017版Library中的标准谱图进行人工检索匹配,结合质谱裂解规律人工解谱,匹配度≥80%同时参照保留时间推定乳汁中的VOCs,按峰面积归一化法仪器自动计算各组分的相对百分含量。或许因为圈养大熊猫乳汁的特殊化学性质,在检出后剔除从色谱柱和SPME头上掉下的硅氧烷等“外来”物质,不计入统计分析。

乳汁样品与测试方法:为了探寻出圈养大熊猫乳汁中较多的香气成分,在HS-SPME-GC-MS分析的总方法下,对不同的乳样采用了不同的HP-SPME处理和GC-MS方法(表2)。

2 结果与分析

2.1 幼仔10日龄时“娜娜”乳汁中的VOCs

按表2进行样品前处理(SPME60℃,4h)和GC-MS方法一测试。经仪器分析,圈养大熊猫“娜娜”在幼仔10日龄时乳汁中的VOCs组成见表3、图1。

表3 圈养大熊猫“娜娜”在幼仔10日龄时乳汁中的VOCs

图1 “娜娜”在幼仔10日龄时乳汁中VOCs总离子流色谱图

共测试出30种VOCs,其中可确定(匹配度≥80%,下同)的VOCs有24种,分别是环戊烷、3-甲基丁醛、1,4-二甲基苯、α-氰基苄醇、1-辛烯-3-醇、苯酚、1,2,4-三甲基苯、1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)环己烯、3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、反式-2-辛烯醛、壬醛、1-甲基-2-异丙基苯、4-烯苯基甲苯、反式-1-丁烯基苯、叔丁基苯、甘菊环、1,3-二乙基-4-甲基苯、2,3-二氢-1,3-二甲基-1H-茚、1,2,3,4,5-五甲基苯、1-甲基萘、2-甲基萘、2,3-二甲基萘、2-乙基萘、1-乙基萘,归类于醇1种、酚1种、醛3种、烷烃1种、烯烃2种、芳香烃15种、含氮化合物1种,有7种成分(匹配度<80%的成分未计入,下同)也存在于羊乳[14]或牛乳[14,15]或猪乳[16,17]中。由表3、图1可知,在幼仔10日龄时“娜娜”乳汁中排前五位的VOCs相对含量合计达76.35%,由高到低依次是3-甲基丁醛(48.77%)、苯酚(14.72%)、1-甲基萘(4.79%)、3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-酮(有待进一步确定,4.20%)、甘菊环(3.87%)。对“娜娜”哺乳仔兽10日龄时乳汁香气的形成可能起到主要或主导作用的成分是3-甲基丁醛和苯酚。3-甲基丁醛具有尖刺的、青香、巧克力样香气[18],苯酚具有酚样、药香气[18],与我们品评的圈养大熊猫乳汁具有青香气息[19]大致相符。

2.2 幼仔23日龄时“娜娜”乳汁1中的VOCs

按照表2进行样品前处理(SPME60℃,2h)和GC-MS方法二测试。经仪器分析,圈养大熊猫“娜娜”在幼仔23日龄时乳汁中的VOCs组成见表4、图2。

表4 圈养大熊猫“娜娜”在幼仔23日龄时乳汁1中的VOCs

注:—表示仪器未自动算出，表5—8同。

共测试出36种VOCs,其中可确定的VOCs有22种,分别属于醇5种、酚4种、醛4种、酮2种、羧酸4种、杂环化合物2种、烯烃1种,有12种成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或猪乳[17]中。由表4、图2可知,在幼仔23日龄时“娜娜”乳汁中排前五位(含1个并列)的VOCs相对含量合计65.45%,由高到低依次是己醛(32.92%)、苯酚(9.92%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(7.58%)、1-戊烯-3-醇(5.73%)、己酸(4.65%)和戊醛(有待进一步确定,4.65%)。对“娜娜”哺乳仔兽23日龄时乳汁香气的形成可能起到主要或主导作用的成分是己醛和苯酚。己醛具有强烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香气[18],苯酚具有酚样、药香气[18],与我们品评的圈养大熊猫乳汁具有新鲜竹叶样青香和新鲜竹秆样青香[19]大致相符。在前一次VOCs测试分析的基础上除3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、反式-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、苯酚4种成分相同外,新发现了18种VOCs(匹配度<80%的成分未计入,下同),分别是:2-甲基-3-丁烯-2-醇、己醛、1-戊烯-3-醇、2-戊基呋喃、1-戊醇、1-辛烯-3-酮、2,3-辛二酮、顺式-2-戊烯-1-醇、反式,反式-2,4-庚二烯醛、乙酸、苯甲醛、丁酸、己酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(1-氧代丙基)苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、吲哚、苯甲酸。与上次测试相比,结果差异可能是因为采用了不同型号的SPME头、不同极性的色谱柱、不同的泌乳时期以及不同厂家的GC-MS联用仪所致。

图2 “娜娜”在幼仔23日龄时乳汁1中VOCs总离子流色谱图

2.3 幼仔23日龄时“娜娜”乳汁2中的VOCs

按表2进行样品前处理(SPME70℃,1h)和GC-MS方法二测试。经仪器分析,圈养大熊猫“娜娜”在幼仔23日龄时乳汁中的VOCs组成见表5、图3。

表5 圈养大熊猫“娜娜”在幼仔23日龄时乳汁2中的VOCs

共测试出30种VOCs,其中可确定的VOCs有20种,分别属于醇3种、酚2种、醛4种、酮3种、羧酸5种、杂环化合物2种、烯烃1种,有12种成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或猪乳[17]中。由表5、图3可知,在幼仔23日龄时“娜娜”乳汁中排前五位的VOCs相对含量合计为50.65%,由高到低依次为己醛(14.29%)、苯酚(13.01%)、戊醛(有待进一步确定,10.27%)、己酸(6.58%)、1-辛烯-3-醇(6.50%)。对“娜娜”哺乳仔兽23日龄时乳汁香气的形成可能起到主要或主导作用的成分是己醛和苯酚。己醛具有强烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香气[18],苯酚具有酚样、药香气[18],与我们品评的圈养大熊猫乳汁具有新鲜竹叶样青香和新鲜竹秆样青香[19]大致相符。在前两次VOCs测试分析的基础上又新发现了反式-2-戊烯醛、2-庚酮、2,5-辛二酮、顺式-2-庚烯醛、顺式-3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、辛酸6种VOCs。与上次测试相比,结果差异可能是因为SPME温度和时长的不同所致。

2.4 幼仔56日龄时“嘉嘉”乳汁中的VOCs

按表2进行样品前处理(SPME70℃,2h)和GC-MS方法二测试。经仪器分析,圈养大熊猫“嘉嘉”在幼仔56日龄时乳汁中的VOCs组成见表6、图4。

图3 “娜娜”在幼仔23日龄时乳汁2中VOCs总离子流色谱图

表6 圈养大熊猫“嘉嘉”在幼仔56日龄时乳汁中的VOCs

共测试出20种VOCs,其中可确定的VOCs有10种,分别属于酚1种、酮1种、羧酸4种、杂环化合物3种、芳香烃1种,有7种成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或猪乳[17]中。由表6、图4可知,在幼仔56日龄时“嘉嘉”乳汁中排前五位的VOCs相对含量合计为99.18%,由高到低依次是2-丁酮(87.78%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(有待进一步确定,4.21%)、3-戊酮(有待进一步确定,3.54%)、己酸(2.81%)、苯酚(0.84%)。对“嘉嘉”哺乳仔兽56日龄时乳汁香气的形成可能起到主要或主导作用的成分是2-丁酮。2-丁酮具有醚香、水果、樟脑、酮香气[18],与我们品评的圈养大熊猫乳汁具有青香气息[19]大致相符。在前三次VOCs测试分析的基础上又新发现了2-丁酮、吡咯和1-甲基-2-吡咯烷酮3种VOCs。与上次测试相比,结果差异可能是因为个体遗传、母兽年龄、泌乳阶段、SPME时长的不同所致。

图4 “嘉嘉”在幼仔56日龄时乳汁中VOCs总离子流色谱图

2.5 幼仔23日龄时“喜豆”乳汁中的VOCs

按表2进行样品前处理(SPME70℃,2h)和GC-MS方法二测试。经仪器分析,圈养大熊猫“喜豆”在幼仔23日龄时乳汁中的VOCs组成见表7、图5。

表7 圈养大熊猫“喜豆”在幼仔23日龄时乳汁中的VOCs

共测试出25种VOCs,其中可确定的VOCs有15种,分别属于醇4种、酚2种、醛3种、酮1种、羧酸3种、杂环化合物1种、芳香烃1种,有11种成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或猪乳[17]中。由表7、图5可知,在幼仔23日龄时“喜豆”乳汁中排前五位的VOCs相对含量合计为91.95%,由高到低依次是苯酚(46.15%)、己醛(18.87%)、2-戊酮(16.09%)、3-己烯-1-醇(5.97%)、己酸(4.87%)。对“喜豆”哺乳仔兽23日龄时乳汁香气的形成可能起到主要或主导作用的成分是苯酚和己醛。苯酚具有酚样、药香气[18],己醛具有强烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香气[18],与我们品评的圈养大熊猫乳汁具有新鲜竹叶样青香和新鲜竹秆样青香[19]大致相符。在前四次VOCs测试分析的基础上又新发现了乙醇、2-戊酮、1,3-二甲基苯、3-己烯-1-醇、苯甲醇、4-甲基苯酚、2,3-二氢苯并呋喃7种VOCs。与上次测试相比,结果差异可能是因为个体遗传、母兽年龄、泌乳阶段的不同所致。

图5 “喜豆”在幼仔23日龄时乳汁中VOCs总离子流色谱图

2.6 幼仔56日龄时“绅宾”乳汁中的VOCs

按照表2进行样品前处理(SPME60℃,4h)和GC-MS方法二测试。经仪器分析,圈养大熊猫“绅宾”在幼仔56日龄时乳汁中的VOCs组成见表8、图6。

表8 圈养大熊猫“绅宾”在幼仔56日龄时乳汁中的VOCs

(续表8)

序号保留时间(min)VOCs名称分子式分子量匹配度(%)相对含量(%)家畜乳汁中的检出情况96.2583,7-二甲基癸烷C12H26170810.94106.521己醛C6H12O1009633.76牛乳[15]、猪乳[17]117.471十二酸甲酯C13H26O221481—127.735反式-2-戊烯醛C5H8O84870.72137.8651,4-二甲基苯C8H10106940.86羊乳和牛乳[14]、猪乳[17]148.6461-戊烯-3-醇C5H10O86721.91159.0882-庚酮C7H14O114890.92牛乳[15]169.163庚醛C7H14O114831.02179.243十二烷C12H26170911.56牛乳[14]189.5812-甲基十二烷C13H28184760.561910.1232-己烯醛C6H10O9883—2010.4172-戊基呋喃C9H14O138941.792110.5614,5-二甲基壬烷C11H24156741.642211.0541-戊醇C5H12O88904.03牛乳[15]2311.4771-甲基-2-异丙基苯C10H14134940.412411.9342-辛酮C8H16O12887—2512.079十五烷C15H32212491.04羊乳和牛乳[14]2612.4221-辛烯-3-酮C8H14O126781.102713.029反式-2-庚烯醛C7H12O112931.542813.1192,3-辛二酮C8H14O2142722.952914.900壬醛C9H18O142901.76羊乳[14]、牛乳[15]3015.2733-辛烯-2-酮C8H14O126870.343115.517顺式-3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯C9H16124870.613215.8602-辛烯醛C8H14O126962.823316.4271-辛烯-3-醇C8H16O128904.423416.5171-庚醇C7H16O116720.703516.845反式,反式-2,4-庚二烯醛C7H10O110950.333617.303乙酸C2H4O260640.33羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、猪乳[17]3717.5472,4-庚二烯醛C7H10O110900.233818.2033,5-辛二烯-2-酮C8H12O124720.283918.353苯甲醛C7H6O106952.38羊乳和牛乳[14]、牛乳[17]4019.0741-辛醇C8H18O130910.554119.432反式,反式-3,5-辛二烯-2-酮C8H12O124300.454220.358苯甲腈C7H5N10383—牛乳[15]、猪乳[16]也检出腈类化合物4320.492反式-2-辛烯-1-醇C8H16O128500.304421.2931-壬烯-4-醇C9H18O142500.254521.373丁酸C4H8O288810.34羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、猪乳[17]4621.631己酸烯丙酯C9H16O2156722.454722.507反式,反式-2,4-壬二烯醛C9H14O13850—猪乳[16,17]4823.567N-乙烯基吡咯烷酮C6H9NO11156—4923.9452-庚基呋喃C11H18O166640.665024.860反式,反式-2,4-癸二烯醛C10H16O152450.88牛乳[15]、猪乳[17]5125.890己酸C6H12O2116803.12羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、猪乳[17]5226.129苯甲醇C7H8O10897—5327.497庚酸C7H14O213064—羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]5428.084苯酚C6H6O94900.47羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]5528.303γ-壬内酯C9H16O2156870.56牛乳[15]5628.861辛酸C8H16O2144970.56羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、猪乳[17]5730.045壬酸C9H18O2158830.18羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]5830.249δ-壬内酯C9H16O2156870.265931.129癸酸C10H20O2172940.19羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、猪乳[17]6032.776吲哚C8H7N11790—羊乳[14]

共测试出60种VOCs,其中可确定的VOCs有39种,分别属于醇4种、酚1种、醛11种、酮4种、羧酸5种、酯1种、内酯2种、杂环化合物3种、含氮化合物1种、烷烃4种、烯烃1种、芳香烃2种,有17种成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或猪乳[17]中。

由表8、图6可知,在幼仔56日龄时“绅宾”乳汁中排前五位的VOCs含量合计为54.45%,由高到低依次是己醛(33.76%)、2-丁酮(8.69%)、1-辛烯-3-醇(4.42%)、1-戊醇(4.03%)、戊醛(3.55%)。对“绅宾”哺乳仔兽56日龄时乳汁香气的形成可能起到主要或主导作用的成分是己醛和2-丁酮。己醛具有强烈的青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香气[18],2-丁酮具有醚香、水果、樟脑、酮香气[18],与我们品评的圈养大熊猫乳汁具有新鲜竹叶样青香和新鲜竹秆样青香[19]大致相符。在前五次VOCs测试分析的基础上又新发现了20种VOCs,分别是2-乙基呋喃、戊醛、3,6-二甲基癸烷、5-甲基癸烷、3,7-二甲基癸烷、十二酸甲酯、庚醛、十二烷、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、3-辛烯-2-酮、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、1-辛醇、苯甲腈、γ-壬内酯、壬酸、δ-壬内酯、癸酸。与上次测试相比,结果差异可能是因为个体遗传、母兽年龄、泌乳阶段、SPME时长不同和嗅感香气较强所致。

图6 “绅宾”在幼仔56日龄时乳汁中VOCs总离子流色谱图

2.7 圈养大熊猫乳汁中的香气成分

综上所述,通过不同型号的SPME头、不同的SPME温度和时长、不同的GC-MS联用仪、不同类型的毛细管柱、不同的程序升温等乳样前处理和仪器分析关键节点的变化对不同个体、不同年龄、不同泌乳阶段、新鲜或不同冻藏天数的圈养大熊猫乳汁进行了测试,旨在较多地探寻出圈养大熊猫乳汁中的VOCs数量。上述6次测试结果共计测出112种VOCs(未计相互之间重复的成分),其中可确定的VOCs共有78种,分别属于醇9种、酚5种、醛14种、酮8种、羧酸7种、酯1种、内酯2种、杂环化合物6种、含氮化合物2种、烷烃5种、烯烃3种、芳香烃16种,可见圈养大熊猫乳汁中的VOCs以芳香烃类、醛类、醇类、酮类、羧酸类等为主;有28种成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或猪乳[16,17]中,分别属于醇1种、酚4种、醛5种、酮3种、羧酸7种、内酯1种、杂环化合物1种、烷烃1种、芳香烃5种,说明大熊猫乳汁与家畜乳汁(羊乳或牛乳或猪乳)既有相同的成分,又存在50种VOCs的较大差异,这可能是因为种间遗传、食物结构、代谢类型及分析方法等不同所致,也可能是大熊猫乳汁香气与羊乳香气、牛乳香气、猪乳香气有差异的直接原因。若将上述6次测试结果(表3—8、图1—6)的VOCs相对含量排前五位的成分合并进行算术平均计算,表明在幼仔10—56日龄时6—14岁的圈养大熊猫乳汁中平均相对含量较高(前十位)的VOCs是:己醛(16.64%)、2-丁酮(16.08%)、苯酚(14.11%)、3-甲基丁醛(8.13%)、己酸(3.15%)、戊醛(3.08%)、2-戊酮(2.68%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(1.97%)、1-辛烯-3-醇(1.82%)、3-己烯-1-醇(1.00%),这些成分对圈养大熊猫乳汁主要香气韵调的形成可能起到主要或主导作用,由此可知醛类(27.85%)和酮类(18.76%)是圈养大熊猫乳汁香气的重要贡献物质种类。

从圈养大熊猫乳汁中测出的VOCs几乎都有一定的气味，或淡或浓，或香或臭，但有些气味物质没有通过甚至没有进行食品安全评估，不能用作食品级单体香原料。圈养大熊猫乳汁中的香气成分是从上述测定的112种VOCs中筛选出国际国内公认、法规允许在食品中添加并可购买的单体呈香物质(即狭义上的香气成分，下同)见表9。结果显示:圈养大熊猫乳汁中可确定的香气成分有46种,分别归类于醇9种、酚3种、醛12种、酮7种、羧酸7种、酯1种、内酯2种、杂环化合物4种、芳香烃1种,可见圈养大熊猫乳汁中的香气成分以醛类、醇类、酮类、羧酸类、杂环化合物等为主,醛类香气成分对圈养大熊猫乳汁香气的形成可能起到重大作用。

表9 圈养大熊猫乳汁中测出的香气成分、香气特征及其国内外食品应用的法规状态

(续表9)

香气成分测出的圈养大熊猫乳样编号123456FEMA编号香气特征[18,20-23]国内外食品应用的法规状态中国美国欧盟日本反式-2-辛烯醛※※?3215尖刺的、脂肪、肉香、青香气√√√√壬醛※???※※2782脂肪、花香、蜡香、柑橘香气√√√√1-甲基萘※3193类似萘、樟脑香气√√××2-乙基呋喃?※3673豆香、面包、麦芽、溶剂样、焦糊香气√√×√2-甲基-3-丁烯-2-醇※※??无××√×己醛※※※※2557强烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香气√√√√2-庚酮?※?※2544水果、青香、奶油、奶酪香气√√√√1-戊烯-3-醇※???3584尖刺的、蔬菜、热带水果、芥末香气√√√√2-戊基呋喃※※※3317果香、青香、壤香、骨粉香、根香香气√√√√1-戊醇※※※※2056苹果、香蕉、酵母、酒香香气√√√√1-辛烯-3-酮※※??3515蘑菇、油腻的气息√√√√2,3-辛二酮※??4060甜的、奶油香√√√√顺式-2-戊烯-1-醇※4305香蕉、青香、橡胶气息×√√×3-辛烯-2-酮??※3416壤香、蘑菇、肉、椰子香气√√√√反式,反式-2,4-庚二烯醛※※3164青香、脂肪、水果、辛香香气√√√√乙酸※※※??2006尖刺的、醋香气√√√√苯甲醛※※?※※2127杏仁、果香、粉香、坚果香气√√√√丁酸※※※※※2221牛奶、奶油、黄油、奶酪、果香香气√√√√己酸※※※※※2559强烈的、腐臭奶酪香气√√√√2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚※2184烘烤谷物香气,抗氧化剂、防腐剂╳×√××辛酸?※※※※2799甜的、干酪、脂肪、青草、油脂香气√√√√壬酸?※2784脂肪、蜡、奶酪、椰子香气√√√√吲哚※※※※2593温和的、动物粪便香气√√√√苯甲酸※※2131极弱的膏香√√√×2-丁酮?※※2170醚香、水果、樟脑、酮香气√√√√戊醛??※3098令人愉快的、面包、巧克力香气√√√√吡咯※3386甜的、令人作呕的香气√√√√乙醇※2419有酒的气息╳×√√×2-戊酮※2842甜的、醚香、香蕉、水果香气√√√√3-己烯-1-醇※无药草香气××√√苯甲醇※※2137甜的、花香、果香香气√√√√4-甲基苯酚※2337药、酚样香气√√√√十二酸甲酯※2715蜡、油、奶油、椰子、蘑菇、葡萄酒、脂肪香气√√√√2-己烯醛※2560青香、辛香、苹果、脂肪、青草、醛香香气√√√√2-辛酮※2802脂肪、花香、青香、牛奶、奶酪香气√√√√反式-2-庚烯醛※3165青香、果香、脂肪、肉香、家禽香气√√√√2-辛烯醛※3215尖刺的、脂肪、肉香、青香气√√√√2,4-庚二烯醛※3164青香、脂肪、水果、辛香香气√√√√1-辛醇※2800青香、柑橘、甜橙、醛香、甜花香、蜡香香气√√√√γ-壬内酯※2781脂肪、椰子、奶油香气√√√√δ-壬内酯※3356甜的、椰子、脂肪、牛奶、奶油、坚果香气√√√√癸酸※2364脂肪、腐臭的香气√√√√具※/有FEMA编号/√物质总数61915813304441444340具?/无FEMA编号/╳物质总数17646425236合计呈香物质总数726211219344646464646

注:香气成分仅限于可在食品中使用的、已商品化的单体呈香物质即单体香原料,以本文表3—8出现的先后为序;FEMA为Flavor and Extract Manufactures Association of the United States的缩写,FEMA编号在国际上普遍采用;国内外食品应用的法规状态汇总资料来源于我国台湾香料协会,2017年12月22日网上发布;※表示匹配度≥80%;?表示匹配度<80%;√表示允许食品中使用;×表示禁止食品中使用。

3 讨论

3.1 圈养大熊猫乳汁香气成因

圈养大熊猫乳汁是有香气的。我们曾对7只圈养大熊猫的乳汁进行过香气品鉴,含有新鲜竹叶样青香、新鲜竹秆样青香、乳香气、奶腥气、乳脂香、奶甜气、酸香气等[19]。测试结果表明，圈养大熊猫乳汁的这些香气均有物质基础,尽管呈香物质的探寻还不彻底,某些香气成分种类可能还不全面,但基本能说明圈养大熊猫乳汁香气形成的直接物质原因。从表9可知,具有青香气息的物质最多,达14种,分别是:3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、反式-2-辛烯醛、己醛、2-庚酮、2-戊基呋喃、反式,反式-2,4-庚二烯醛、辛酸、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、1-辛醇,其中己醛为圈养大熊猫乳汁中平均相对含量(6次测试的算术平均值)最高的香气成分,因其香气阈值较低,对圈养大熊猫乳汁香气有重大贡献,这就不难解释为什么圈养大熊猫乳汁具有较强的新鲜竹叶样青香气和新鲜竹秆样青香气,这些成分可能共同构成了圈养大熊猫乳汁的特征性香气。乳香气可能与丁酸、己酸、δ-壬内酯、癸酸等有关,奶腥气可能与己醛、2-己烯醛[24]、1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇[25]等有关,乳脂香气可能与庚醛、反式-2-辛烯醛、壬醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛、辛酸、壬酸、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、γ-壬内酯、δ-壬内酯、癸酸等有关,奶甜气可能与2,3-辛二酮、辛酸、吡咯、2-戊酮、苯甲醇、1-辛醇、δ-壬内酯等有关,酸香气主要与乙酸等挥发性羧酸有关。可见圈养大熊猫乳汁中的某种香气并非单独由1种香气成分引起,而是多种呈香物质相互作用(协同增效或抵消减弱)结果的综合表象。圈养大熊猫个体间乳汁香气可能因为遗传、年龄、泌乳阶段、食物结构等因素的不同而存在一定差异[19],是因为不同泌乳阶段、不同年龄、不同个体的VOCs种类数量及其相对含量不尽相同所致(表3—8),这在圈养大熊猫乳汁香气成分的探寻结果得到验证(表9)。这些香气成分可能来源于圈养大熊猫机体尤其是母兽乳腺物质代谢的中间产物或最终产物,也可能从食物中经机体血液转移到乳汁中[26]。

3.2 圈养大熊猫乳源性化学信息素刍议

用HS-SPME-GC-MS法从圈养大熊猫乳汁中测定出的有机化学物质和香气成分都有挥发的物理特性,不但可在空气中向外扩散,而且香气成分还有不同韵调、不同强度的香气,可向幼仔传递某些信息,因此圈养大熊猫乳汁的香气具备化学信息素的功能,称之为乳源性化学信息素。表9中选列出的呈香物质多为调香师常用的单体香原料，我们的调香实践证实，即使呈香物质数量相同,只要有1种呈香物质添加量不一样,香气就有一定程度的差异,甚至香型发生改变。圈养大熊猫乳汁中如此多的呈香物质再加上每种呈香物质的含量变化可组编出很多种不同韵调的香气,形成不同个体、不同年龄、不同泌乳阶段的个性化香气或特征性香气。据此认为圈养大熊猫乳源性化学信息素并非简单的1种呈香物质,而是由多种挥发性呈香物质组成的,以某种香气形式供幼仔凭借日益发育成熟的嗅觉来感知和识别,达到遗留标记或传递某种信息的目的。大熊猫成体的视力较差[27],幼体的嗅觉发育早于听觉和视觉[28],由于幼仔熟悉了各自母亲的乳汁气味,才有可能发生“各找各妈”的母子之间互动现象。乳源性化学信息素除标记自己的幼仔和哺乳地点外,主要作用是激发幼仔采食欲望,吸引幼仔前去吸乳,或许还有其他未被人们知晓的功效。

3.3 圈养大熊猫乳汁中VOCs测试结果影响因素

因圈养大熊猫乳汁的稀缺性,难以采得大量乳样进行多方法多途径探究其香气成分,如有机溶剂蒸馏提取法需乳量较多,故采用HS-SPME-GC-MS联用法测试圈养大熊猫乳汁中的VOCs是切实可行的，能探寻出圈养大熊猫乳汁中的香气成分，上述的测试结果也证实了该方法的可靠性。但不同的SPME温度和时长、SPME型号、GC-MS联用仪生产厂家和新旧程度、程序升温、解吸时间长短、毛细管柱类型和长度、谱库是否最新版本、自动检索还是人工检索,都会有不同的结果,且圈养大熊猫哺乳母兽的日粮构成、泌乳阶段、健康状况、年龄、遗传因素等自身条件,采集样品时的气温等环境因子也是重要影响因素。嗅感圈养大熊猫乳汁香气较强时,测试效果较好,这在圈养大熊猫“绅宾”乳汁的测试结果(表8)得到佐证。本文是按照表2方法取得的结果,但我们相信圈养大熊猫乳汁中VOCs远不止这些成分。由于此前未见国内外有关圈养大熊猫乳汁中VOCs和香气成分方面的报道,我们仅在这方面进行了首次探索性研究,可供以后分析圈养大熊猫乳汁中的VOCs和探究圈养大熊猫乳源性化学信息素参考。

3.4 圈养大熊猫乳汁香气成分的应用意义

圈养大熊猫乳汁气味具有独特性,在特征性香气方面有别于牛乳、羊乳等哺乳动物的乳汁。若用其它动物乳汁或奶粉补饲或全饲大熊猫幼仔,因风味差异,缺少母乳的特有香气,幼仔不熟悉这些乳汁或奶粉的气味,会造成一段时间不愿采食,影响营养物质的摄入,导致生长发育减缓甚至健康水平下降。可根据圈养大熊猫乳汁的风味特征[19]和上述测出的香气成分,模拟圈养大熊猫乳汁的天然香气,调制大熊猫幼仔专用诱食剂,让人工乳、代用奶、窝窝头等食物具有“妈妈”的乳味,使幼仔采食过程具有安全感、亲切感和幸福感,缓解从自然母乳向人工食物变换而引起的应激反应,增强幼仔采食欲望。圈养大熊猫幼仔专用诱食剂在本质上就是人工仿制的大熊猫乳源性化学信息素，遵照圈养大熊猫乳汁香气的共同特点，采用多种香原料调制而成，以某种强度的母乳样香气赋予大熊猫幼仔的人工食物，吸引幼仔采食，便于人工乳和代用奶的平稳使用，利于幼仔食物由液态向固态的渐进过渡，也有助于破解大熊猫幼仔的化学生态觅食效应之谜。

本研究结果不仅为圈养大熊猫乳汁香气的形成找到了部分直接物质,也为研制圈养大熊猫幼仔专用诱食剂提供了部分原料选择的依据。表9所列46种单体呈香物质中有5种是我国食品安全国家标准----食品添加剂使用标准(GB 2760-2014)中不允许使用的，分别是2-甲基-3-丁烯-2-醇、顺式-2-戊烯-1-醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、乙醇、3-己烯-1-醇,因此在调制圈养大熊猫幼仔专用诱食剂时应规避使用上述5种呈香物质,其余41种均可作为单体香原料，在严格遵守国家有关规定的前提下酌情酌量选用。

(致谢:本研究的实施过程中,中国大熊猫保护研究中心的有关领导和科研动管处黄炎教授级高级工程师、屈元元工程师在批准采集乳样时给予了支持,卧龙神树坪基地的董超、杨长江、曾文、程建斌等同仁在乳样采集时热情相助,四川大学分析测试中心的丁小东副研究员、中国科学院成都分院分析测试中心的胡静副研究员、农业部沼气科学研究所的周正工程师在成分分析和推定方面提供了帮助,在此一并深表谢意！)