非洲猪瘟实验室检测技术研究进展

吴丹 冬冬 李伟 张夏平 赵达卓

摘 要 非洲猪瘟作为一种新型的外来病毒，在我国发生疫情后迅速蔓延，引起了严重的猪养殖经济损失，非洲猪瘟病毒也因此被我国定位一类动物疫情。该病具有高死亡率和高传染性，最高时死亡率高达100%，与部分高温疾病及猪瘟有类似之处，一般临床经验诊断较为困难，需要借助实验室检测技术确诊。本文就来分析非洲猪瘟实验室检测技术研究进展。

关键词 非洲猪瘟；实验室检测技术；研究进展

1 引言

2019年上半年我国猪肉价格在全国范围内暴涨，平均猪肉价格涨幅高达9.3%。快速上涨的猪肉价格令市民措手不及。那么猪肉价格为什么会涨幅如此之快呢？原因是2018年我国爆发了非洲猪瘟，对养猪业造成了重大的打击。大部分的中小规模养猪户因此陷入经济危机，遭到破产，资不抵债。

2 非洲猪瘟的临床症状

非洲猪瘟有着较长的潜伏期，一般由2-9天，平均持续时间四天，从病发到死亡仅需要2-7天。最明显的临床症状就是高热症状。患有非洲猪瘟的病猪体温最高是达到41℃，病猪临死前48小时体温开始下降。此外，病猪表现为食欲不振、行动虚弱、脉搏较快、呼吸加速并伴随呼吸困难，咳嗽加重，还会患有结膜炎，伴随呕吐、下痢。临床解剖检验，发现血红代办递减50%，随着体温升高具有白血球性贫血症，身体汇总的淋巴球数量也相应减少，最低时下降至40%。身体上表现为蹄、尾、会阴、腹部、腋下、鼻、耳朵乳头等部位掉毛，并发生紫色斑。生斑部位发生肿胀，斑点中心部位发生分散性出血症状。解剖可见内脏多处部位膜内发生红色瘀斑，胸膜部位发生新报出血，多处淋巴部位发生结节。此外，脾脏系统发生栓塞和肿胀，血液循环系统发生多处充血，呼吸系统发生扩散性充血或瘀斑[1]。

3 非洲猪瘟实验室检测技术

3.1 病原學检测

3.1.1 病毒分离鉴定

非洲猪瘟病毒分离需要在具有三级以上生物安全的实验室进行。主要包括分离病死猪的心脏、脾脏、肝脏等组织器官，用于分离病毒细胞。感染非洲猪瘟病毒的病猪单层猪外周血单核细胞具有血细胞吸附特性及细胞死亡的特征。检测到细胞呈阳性时则可确诊为感染ASFV病毒。

3.1.2 荧光抗体试验

将采集的白雪细胞培养物图片使用ASFV抗原进行鉴定，用荧光标记抗体分离兵卒，特异性高则为感染非洲猪瘟。该实验室检测方法检测准确性高，见效快，但由于荧光显微镜、荧光标记抗体价格较快，因此检测应用范围受到限制。

3.1.3 红细胞吸附试验

非洲猪瘟的血红细胞通过抗血清阻断吸附病毒，抗体对同源病毒产生抑制，红细胞吸附实验用于鉴定抗原的差异性和抗体的效价。大部分的非洲猪瘟分离后具有HAD活性，这类病毒本身不具有致病性。但是这类病毒能够在白细胞培养的过程中发生病变，缺乏红细胞吸附能力，而这类病毒具有致病性。再对血红细胞的吸附性进行鉴定，检测病毒的敏感性，病毒的敏感性月为92%，这说明存在致病性非洲猪瘟病毒。使用该方法检测非洲猪瘟病毒，检测时间最快也需要3天，长则需要10天，因此不适用于紧急情况病毒检测。

3.2 血清抗体检测

3.2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附实验是建立在便宜学反应基础上的。通过抗体、抗原的反应与酶对底物高效催化反应的敏感性来监测免疫反应。2014年，董志珍应用基因重组制备非洲猪瘟病毒，从小白鼠身上获得单克隆抗体，并通过竞争法ELISA检测非洲猪瘟病毒的特异性，特异性高且无交叉性，其灵敏度为100%。该方法主要用于非洲猪瘟流行病学的检测，肥猪猪瘟抗体具有阻断ELISA、间接ELISA。

3.2.2 胶体金免疫层析技术

该技术将胶体金作为示踪标志物，是一种检测抗原抗体的免疫标记技术。2017年，林彦星等人合成多肽，并将其与牛血清白蛋白进行偶联，从中选出具有抗原性的多肽检测非洲猪瘟抗体胶体金免疫层析纸条。胶体金免疫层析技术具有较强的敏感性和特异性，试纸检测方便、快捷，应用范围较广。胶体金免疫层析试纸检测非洲猪瘟病毒的准确率高达100%，是快速检测非洲猪瘟最有效的方法，在临床诊断非洲猪瘟方面有着及其广泛的应用[2]。

3.2.3 间接免疫荧光试验

该技术是利用特异性抗体与标本中相的抗原反应来用荧光标记抗体检测病毒的方法。1970年，Sanchez建立了非洲猪瘟抗体IIF检测技术。由于IIF具有较高的敏感性，因此使用该技术检测非洲猪瘟病毒的时间较短。在实际的应用中，由于酶联免疫吸附试验的检测结果不稳定，受环境因素影响较大，因此会产生非特异性染色，从而影响检测结果。

3.3 分子生物学检测

分子生物学检测主要指核酸检测法。PCR核酸检测技术是一种高敏感性、高特异性检测技术，且操作简单，检测成本较低，在非洲猪瘟早期病毒诊断方面有着及其广泛的应用。非洲猪瘟病毒基因中含有保守基因序列，根据非洲猪瘟病毒特异性扩增，检测器核酸章台。使用分子生物学检测非洲猪瘟，检测无可以是病猪的分泌物、血液、组织等，不仅对于检测样本要求不高，且检测效果灵敏、迅速。分泌物、血液属于相对易采集的监测样本，在早期非洲猪瘟病毒诊断检测方面适用性较好。目前，分子生物监测法主要选取非洲猪瘟的P72基因进行检测，它具有高度保守序列设计出引物，从中就可提取出病毒样本[3]。

4 结语

综上所述，非洲猪瘟实验室检测技术是目前防控非洲猪瘟最有效的方法。鉴于上一次国内爆发的非洲猪瘟及其因此而造成的惨重的损失，现阶段，农业部门应该联合养殖户做好猪的自检与抽检，确保健康猪肉的流通，为消费者提供品质保障的猪肉，同时也优化养猪环境，维持我国养猪业健康平稳发展。

参考文献：

[1]王子坚，贺奋义，郭慧琳，魏润生.非洲猪瘟检测技术研究进展[J].国外畜牧学（猪与禽），2016（01）：48-49.

[2]刘贺.非洲猪瘟诊断技术研究进展[J].动物医学进展，2019（07）：108-110.

[3]庄金秋，梅建国，谢金文，李峰，沈志强.非洲猪瘟病毒实验室检测方法研究进展[J].饲料与畜牧，2017（22）：32-36.