川芎嗪氨类衍生物合成方法工艺优化及抗血小板聚集活性评价

曾凡鹏，胡 光，罗丽梅，吴翔宇，郑一敏

(重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400054)

川芎嗪(ligustrazine,Lig)是从药材川芎(RhizomaChuanxiong)中分离提纯出的生物碱单体[1]。川芎嗪具有抑制血管平滑肌痉挛、改善心肌缺血、抑制血小板聚集、改善血液流变性[2-5]及抗自由基等特点，作为天然活性成分在药物设计合成中被广泛应用[6-10]，临床上主要用于缺血性心脑血管疾病的治疗[11-13]。现有临床上治疗心脑血管疾病药物，往往会造成出血副作用大、耐药、代谢快等缺点[14-15]。

陈鸿飞等[16]报道川芎嗪衍生物合成条件为K2CO3碱性环境，60 ℃、6 h，使用甲苯进行减压蒸馏除去DMF，乙酸乙酯与水进行萃取分离有机相，产率为60%左右，同时在中间体的制备过程中使用二氯亚砜卤代反应，该方法反应剧烈且试剂较刺激，但未见文献报川芎嗪氨类衍生物抗血小板聚集实验。

本研究以川芎嗪为先导化合物，采用溴代卤化法制备中间体，使用NaH作为碱性环境，后处理不需要进行过滤除去固体K2CO3，同时加入了相转移催化剂。通过单因素实验筛选最佳的温度、时间以及原料配比，再采用正交试验进行工艺优化，产率提高了20%左右，并对目标产物采用质谱和核磁结构进行了确认，随后进行了抗血小板聚集实验，实验现报道如下。

1 试验

1.1 仪器与试剂

仪器：核磁(NMR)-600 MHz测定(CDCl3，TMS为内标，瑞士Bruker公司)；ZF-I型三用紫外分析仪(蓝尼诗尔商贸有限公司)；Finnigan-LCQDECA (ESI-MS)(美国热电公司)；PSL-1810型磁力搅拌低温槽(EYELA东京理化器械株式会社)。

试剂：无水三乙胺、K2CO3、N,N-二甲基酰胺、(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇(阿达玛斯试剂公司)。

1.2 合成方法

以三溴化磷和(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇为原料，以四氢呋喃为溶剂，反应得到2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪，再与化合物对氨基苯甲酸甲酯化合物经过亲核取代反应得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸甲酯川芎嗪氨类衍生物，最后经过水解得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3d)，川芎嗪氨类衍生物合成路线如图1所示。

图1 川芎嗪氨类衍生物合成路线

1.2.12-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪中间体的制备

在氩气保护、无水条件下，将双颈圆底烧瓶置于低温反应器中冷至-5 ℃，加入5.0 mmol PBr3冷却并搅拌5 min，再加入无水三乙胺0.34 mL继续搅拌2～3 min，再称取15.2 mmol(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇溶于20 mL 四氢呋喃溶液中，用滴液漏斗缓慢滴加到双颈圆底烧瓶中，待滴加结束后，将反应装置转移至室温反应8 h，TLC板检测反应，反应结束后真空旋除残留溶剂，残留物加冰水进行淬灭，并用乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，真空旋除溶剂，残留物经硅胶柱层析进行分离纯化，最后得到2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪。

1.2.24-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸的合成

在氩气保护、无水条件下，将双颈圆底烧瓶置于低温反应器中冷却至-5 ℃，称取200 mgNaH置于25 mL的双颈圆底烧瓶中，再加入一定量对氨基苯酯类化合物，再称取2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪531.6 mg，相转移催化剂四丁基碘化铵0.05 g，最后量取15 mL N,N-二甲基酰胺溶剂加入双颈圆底烧瓶中。反应温度85 ℃、8 h得到目标产物，硅胶柱分离纯化得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3d)川芎嗪衍生物。

1.2.3结构确认

m.p.131-133℃.1H NMR (MeOD,150 MHz)δ=6.73(s,1H,Ar-H),7.81(s,1H,Ar-H),6.75(s,1H,Ar-H),7.82(s,1H,Ar-H),2.56(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3),2.52(s,3H,CH3),4.46(s,2H,CH3).13C NMR (MeOD,600 MHz)δ=152.53,151.81,151.81,149.63,148.66,148.27,147.40,131.31,131.21,118.14,112.20,45.47,19.82,19.66,18.69.川芎嗪衍生物3d结构谱图1H NMR(见图2)和13C NMR(见图3)。

图2 化合物3 d的13C NMR

图3 化合物3d的1H NMR

1.3 抗血小板聚集试验方法

将制备好的富血小板血浆放在摇床里37 ℃温育20 min，用移液枪吸取180 μL温育好的PRP加入96孔板中，加样时避免产生气泡，如果有气泡用加热的针头扎破。再加入10 μL待测药品，终浓度为100、50、25、12.5、6.25 μg/mL，37 ℃温育振摇5 min，将酶标仪设置为震动1次时间为10 s，波长为570 nm。将96孔板置于酶标仪上快速震摇10 s测定吸光度，每30 s测定1次，连续测3次，记各孔3次吸光度均值为A0。之后加入诱导剂，诱导剂二磷酸腺苷(ADP)终浓度为5 μmol/L，继续每30 s测定一次吸光度直至吸光度不再变化，记平行孔的吸光度均值为A，阿司匹林为阳性对照。

1.4 工艺优化

本工艺主要对第2步2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪与对氨基苯甲酸甲酯化合物反应合成的川芎嗪氨类衍生物进行单因素和正交试验，以考察反应条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1反应溶剂的考察

反应溶剂对收率的影响考察结果见表1。

表1 反应溶剂对收率的影响

由表1可知：乙腈、四氢呋喃沸点较低，不能满足实验要求的温度。使用甲苯产率也相对较低，为60%。选择DMF作为溶剂，产率可高达91%。

2.1.2反应时间的考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪为定量，选择DMF为溶剂，改变反应时间，考察反应时间对收率的影响，结果见表2。

表2 反应时间对收率的影响

由表2可知：随时间延长，反应产率不断变大，8 h反应进入高峰期，11 h收率下降。

2.1.3原料配比考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪为定量，改变对氨基苯酯类化合物的量，考察了原料配比对收率的影响，结果见表3。

表3 反应原料配比对收率的影响

由表3可知：反应原料配比为1∶0.8时，收率可达72%；增加对氨基苯酯化合物的量，收率变大，当配比为1∶1.2时收率最大，继续增加对氨基苯酯化合物的量，收率变小。

2.1.4反应环境考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪为定量，考察了反应环境碱性的强弱对收率的影响，结果见表4。

表4 反应环境对收率的影响

由表4可知：碱性强弱对反应的收率有较高的影响。K2CO3的收率为52%。强碱NaH的收率高达89%。

2.1.5反应温度考察

由表5可知：温度对反应的收率有较高的影响。65 ℃时的收率为68%，85 ℃时的收率高达88%。

表5 反应温度对收率的影响

2.2 正交试验

根据单因素考察预实验结果，选择反应时间(A)、反应配比(B)、反应温度(C)3个因素为考察因素，截取各因素3个水平，进行L9(34)正交试验，因素及水平见表6，正交试验见表7，方差分析结果见表8。

表6 因素水平

水平A(反应时间/h)B(反应温度/℃)C(反应配比)14651∶128851∶1.23121001∶1.4

表7 正交实验L9(34)结果分析

表8 方差分析

从表7正交实验L9(34)结果分析得出：最优的组合为A2B2C3，即反应时间为8 h，反应配比为1∶1.2，反应温度为85 ℃时产率最高。从表8方差分析可以看出：反应时间(A)、反应温度(B)对产率有显著的影响(P<0.05)，而反应配比(C)对产率影响相对不大。

2.3 实验活性评价

通过正交试验筛选的最佳合成路线得到的4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3 d)，其抗血小板聚集实验活性要好于阳性对照阿司匹林IC50=37.38<42.96，数据统计见表9、10。

表9 阿司匹林对血小板聚集的影响

表10 阿司匹林对血小板聚集的影响

3 讨论

根据单因素和正交试验获得的合成目标产物收率，确定了本工艺合成的最佳实验条件：反应溶剂为DMF、反应时间为8 h、反应配比为1∶1.2、碱性环境为NaH、反应温度为85 ℃。

本工艺方法比传统方法收率更高，反应过程检测及后处理变得简单，同时原料易获得。得到的川芎嗪衍生物的收率高达88%，比文献报道的合成方法得到的产物收率提高了20%，实验后处理不需要过滤分离，更节省时间，本实验采用三溴化磷作为卤化反应的亲和试剂，而氯化亚砜有刺激性臭味反应剧烈，在使用氯化亚砜的过程中会生成大量HCl和SO2，对环境造成污染，同时氯化亚砜易发生水解反应，造成产率下降。因此，本合成工艺对环境污染很小。

抗血小板聚集实验结果表明：本研究合成的川芎嗪衍生物具有抗血小板聚集作用且效果好于阳性对照阿司匹林。本研究合成的川芎嗪衍生物羧基在15位碳原子上，16位和17位羧基取代活性还需进一步研究；同时，血小板在制备的过程中，抗凝剂会对实验分析产生误差，防止血凝的方法还需要改进。