急性邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)暴露对黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)幼鱼炎性反应相关基因表达的影响

张木子， 袁莉霞， 黎 明， 王日昕

(宁波大学 海洋学院， 宁波 315211)

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，杂食偏肉食性，在我国南方是一种非常重要的名优经济养殖鱼类，其肌肉中富含人体所需的多种必需氨基酸，尤其是没有肌间刺的优点，深受广大老百姓的喜爱。随着市场需求量的不断上涨，据《2017中国渔业统计年鉴》[11]发布的权威数据显示，截至2016年底，全国黄颡鱼产量达到42万t，业已成为我国重要淡水养殖种类之一。本实验室前期研究表明，DEHP暴露能够影响黄颡鱼生长、抗氧化、免疫力及抗病力，基于这个发现，本研究旨在评估急性DEHP暴露对黄颡鱼炎性反应相关基因(TNF、IFN和IL8)表达的影响，试图查明炎性反应与DEHP中毒之间可能的联系。

1 材料与方法

1.1 养殖管理及取样

黄颡鱼幼鱼购自浙江嘉兴，毒性实验在宁波大学校内基地进行。暂养30 d后，挑选270尾体格健壮、大小均匀的鱼苗(1.80±0.20)g，随机分配到9个300 L塑料养殖桶中(每个处理设置3个重复)，每桶30尾。基于自然水体中DEHP最低浓度0.1 mg/L，以及约9.5 mg/L DEHP半致死浓度[2，10]，实验设置3个DEHP处理组，分别为对照组(0 mg/L DEHP)、中浓度组(0.1 mg/L DEHP)和高浓度组(1 mg/L DEHP)，胁迫周期为96 h，期间停止投喂饲料。DEHP(Bellefonte, 美国)原液在0.1 mg/L tween 80助溶剂中溶解后，进一步稀释到期望浓度。DEHP浓度的测定采用高效液相色谱法(HPLC)[12]。整个实验过程中，水温26 ℃～28 ℃，溶氧(7.81±0.13)mg/L，亚硝酸盐<0.5 mg/L，保持自然光照。

实验开始后，分别于0、12、24、48和96 h取样，每次每桶随机挑选3尾实验鱼，MS-222麻醉后解剖获取肝脏，液氮速冻，-80 ℃保存，备用。

1.2 基因mRNA表达量分析

黄颡鱼肝脏的总RNA的提取采用RNAiso Plus试剂(TaKaRa，大连)，利用Prime ScriptTMPT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大连)反转录成cDNA用于实时荧光定量PCR分析。利用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1)。实时荧光定量PCR(SYBR Premix ExTaqII，TaKaRa，大连)，扩增程序为95 ℃预变性5 min；40个循环包括95 ℃变性 20 s，57 ℃退火 25 s，72 ℃延伸 25 s。采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量[13]。

表1 黄颡鱼炎性反应相关基因和内参基因RT-PCR引物序列

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 DEHP不同暴露时间对TNF基因表达的影响

在96 h暴露过程中，对照组实验鱼肝脏中TNF基因表达量无显著性变化(P>0.05)，见图1；中、高浓度组实验鱼肝脏中TNF基因表达量呈先升高后降低趋势，表达量最高值分别出现在24和12 h(P<0.05)；DEHP暴露达12 h时，高浓度组实验鱼肝脏中TNF基因表达量显著最高，其次是中浓度组，而对照组TNF基因表达量最低(P<0.05)；暴露时间分别达24、48和96 h时，中浓度组实验鱼肝脏中TNF基因表达量显著高于高浓度组(P<0.05)。

2.2 DEHP不同暴露时间对INF基因表达的影响

在96 h暴露过程中，对照组实验鱼肝脏中IFN基因表达量无显著性变化(P>0.05)，见图2；中浓度组实验鱼肝脏中IFN基因表达量呈先升高后降低趋势，而高浓度组则呈逐渐降低趋势(P<0.05)；暴露时间分别达12、24、48和96 h时，中浓度组实验鱼肝脏中IFN基因表达量均显著最高，其次是对照组，而高浓度组IFN基因表达量显著最低(P<0.05)。

不同大写字母(A、B、C)表示DEHP暴露浓度的影响存在差异性显著; 不同小写字母(a、b、c)表示DEHP暴露时间的影响存在差异性显著(P<0.05)。下同

图1 DEHP对黄颡鱼肝脏TNF基因表达的影响

Figure 1 The effect of DEHP onTNFgene expression in liver of yellow catfish

图2 DEHP对黄颡鱼肝脏IFN基因表达的影响

2.3 DEHP不同暴露时间对IL8基因表达的影响

在96 h暴露过程中，对照组实验鱼肝脏中IL8基因表达量无显著性变化(P>0.05)，见图3；中、高浓度组实验鱼肝脏中IL8基因表达量呈先升高后降低趋势(P<0.05)；DEHP暴露达12 h时，中浓度组实验鱼肝脏中IL8基因表达显著最高，其次是高浓度组，而对照组IL8基因表达最低(P<0.05)；暴露时间分别达24、48和96 h时，对照组实验鱼肝脏中IL8基因表达量显著最高，而中浓度组实验鱼肝脏中IL8基因表达量显著高于高浓度组(P<0.05)。

3 讨论

在哺乳类，经大量研究证实，邻苯二甲酸酯类化合物(如DEHP)能够激活炎性细胞中的细胞因子和炎性相关因子，加剧炎性反应进程，继而对机体的免疫系统造成损伤[6]。王佳等[14]在人单核细胞白血病细胞株THP-1的研究中发现，1 μmol/LDEHP是通过诱导MMP-8、IL-1β等基因和蛋白的表达，诱导细胞内产生氧自由基(ROS)，从而激发炎症反应。Oh等[15]报道，100 μmol/L DEHP能使人HMC-1细胞系中炎症性介质IL-1β和COX-2的表达量显著增加。但在低等动物(包括鱼类)中，DEHP暴露诱发炎症反应及免疫损伤的研究仅见零星的报道。Lee等[16]报道，1 μmol/LDEHP暴露能够显著上调摇蚊(Chironomustentans)热休克蛋白(HSP)基因和蛋白的表达量；Lu等[2]发现，0.2 μg/LDEHP暴露上调了菲律宾蛤仔免疫相关基因(如CypA-1和HSP90)的表达；Huang等[17]研究表明，青鳉鱼(Oryziasmelastigma)暴露到1 mg/LDEHP中，肝脏中IL1β基因的表达量显著上调。肿瘤坏死因子是一类多功能的细胞内信号接头分子，由活化的巨噬细胞产生，在细胞内能够与下游信号分子相互作用，诱导炎症反应，在增强机体免疫应答反应中发挥重要作用，但过多的肿瘤坏死因子会造成组织损伤[18]。本研究发现，中浓度的DEHP激活了实验鱼肝脏中TNF的表达，但持续暴露达24 h后，TNF的表达量达到饱和。相比而言，高浓度DEHP暴露能够在12 h内迅速升高TNF的表达量，这种现象可能是由于高浓度的DEHP在短期内引起“毒性兴奋效应”[19]造成的，但随着暴露时间的延长，其表达量逐渐降低到对照组之下。本研究提示，黄颡鱼肝脏中TNF基因的表达与DEHP之间存在明显的剂量依赖效应，低浓度的DEHP能够激活肝脏中TNF基因的表达，但DEHP暴露浓度超过生理耐受阈值时，其mRNA的表达量将受到显著抑制。

图3 DEHP对黄颡鱼肝脏IL 8基因表达的影响

干扰素在机体应答环境胁迫(如病毒感染)的过程中发挥重要作用。在哺乳类研究中已证实，IFN是典型的Th1分泌细胞因子，通过激活IL12刺激先天免疫和适应性免疫系统对外源异物进行清除[20]。黄贝等[21]报道，受到异源性抗原物质刺激后，斑点叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)、虹鳟和石斑鱼(Epinepheluscoioides)血细胞中IFN基因的mRNA表达水平显著提高。与上述报道相同，本研究发现，中浓度DEHP暴露显著上调了黄颡鱼肝脏中IFN基因的mRNA表达量。然而，高浓度的DEHP暴露却抑制了实验鱼肝脏中IFN的表达，INF的表达量在96 h毒性胁迫过程中持续下降。结果提示，低浓度DEHP暴露通过上调IFN的表达参与机体免疫应答，但高浓度DEHP暴露则会对正常的生理活动造成抑制。

在本研究中，与TNF和IFN基因的表达情况相比，实验鱼肝脏中IL8基因的表达更易受到DEHP毒性的影响。DEHP暴露达12 h时，中、高浓度组实验鱼肝脏中IL8基因的表达量均显著高于对照组，这种现象可能是一种机体自身的生理保护策略，以避免过度诱发细胞凋亡。庞雪利等[22]在临床研究中发现，细胞培养基中IL 8含量的升高，能够激活细胞中PI3K/AKT信号通路，从而上调Bcl-2、下调caspase-3基因mRNA的表达量，达到抑制细胞凋亡的目的，并通过Western Blot做出进一步的验证。Ghosh等[23]提出，短期高浓度DEHP暴露能够减少NF-κB信号通路的活化，减少由于细胞凋亡过度激活对机体造成的伤害。本研究还发现，随着DEHP暴露时间的延长，中、高浓度组实验鱼肝脏中IL8基因的表达量均显著下降，且低于对照组。结果提示，鱼类能够通过调控细胞凋亡和炎症反应，在短期内阻止DEHP对免疫系统造成的伤害，但这种防御机制受到生理耐受阈值的限制。

4 结论

综上，本研究发现，黄颡鱼肝脏中炎性反应相关基因的表达与DEHP之间存在明显的剂量依赖效应，低浓度的DEHP能够激活炎性反应相关基因的表达，而高浓度的DEHP暴露将抑制炎性反应相关基因的表达。