低温胁迫后五味子‘嫣红’叶片形态和叶绿素荧光参数的变化

许培磊，韩先焱，范书田，王月，张宝香，李昌禹，艾军，路文鹏※，吴汉

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林农业大学园艺学院，长春 130118；3.荏平县信发街道林业站，山东 聊城 252000）

五味子〔Schisandra chinensis (Turcz.) Baill〕主要分布于中国东北、朝鲜半岛、日本、韩国及俄罗斯的远东地区，其果实为我国的常用名贵中药材。近年来，五味子人工栽培迅猛发展，由于五味子原生境多为半阴生环境，空气湿润、温度变化缓和，而在人工栽培条件下叶片常常受到霜害等不利环境条件的影响，影响植株的生长和正常开花结果[1]，影响产量和经济效益。早春霜害一般发生在每年的5 月5～20 日，常出现1～2 次3～ 2 ℃低温。东北地区五味子种植区每年都会发生不同程度的霜冻危害，程度比较轻的部分枝叶冻伤和花器官受害，严重的则直接导致死亡[2]。五味子栽培面临减产和颗粒无收的风险。叶绿素荧光分析技术可以快速、灵敏地检测植物光合生理状况，直观地显示低温对植物的胁迫及植株的抗性[3]。因此，本研究对低温胁迫下五味子叶片的荧光特性进行检测，旨在为筛选五味子抗低温种质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取中国农业科学院特产研究所五味子资源圃中‘嫣红’品种为试材，选择生长势、株高大致相同的2 年生盆栽嫁接植株18 盆，于2016 年8 月上旬，每株选取叶片大小、生长状况一致的向阳健康成熟叶片为试材供测定。

1.2 方法

将五味子品种‘嫣红’盆栽苗放在1 ℃和6 ℃的环境中处理1、2、3 d，每个处理选3 盆植株，在不同处理时间运用叶绿素荧光成像仪对叶片的荧光参数进行测定、成像分析和石蜡切片观察。

1.2.1 石蜡切片方法 植物组织结构的观察采用石蜡切片法，将经FAA 固定的试验材料，通过叔丁醇梯度脱水、渗蜡、浸蜡、包埋等过程，用自动切片机切片，切片厚度10～12m，番红-固绿对染，加拿大树胶封片，显微镜观察并照相，图片放大倍数为100 。

1.2.2 叶绿素荧光成像观察 采用叶绿素荧光成像系统测定叶绿素荧光参数，叶片经暗适应20 min，将待测叶片置于样品台，每个叶片上设定3 个直径1 cm的自动光学检测（AOI），调节测量光0.5mol（/m2·s），测定初始荧光Fo，设置光化光强度PAR 为205mol（/m2·s）（植物用来进行光合作用，与生长环境光强一致），饱和脉冲强度为2 700mol（/m2·s），持续时间为0.8 s。在软件的Kinetics窗口检测各叶绿素荧光参数的动力学变化曲线，相应数据可直接从Report 窗口导出。相关的叶绿素荧光参数包括光合系统Ⅱ（以下简称 PSⅡ）的最大量子产量Fv/Fm（PSⅡ原初光能转化率）、PSⅡ的实际量子产量PSⅡ、调节性能量耗散的量子产量Y（NPQ）、非调节性能量耗散的量子产量Y（NO）、电子传递速率rETR。

2 结果与分析

2.1 五味子叶片形态结构观察

五味子叶片叶肉组织由上表皮（a）、栅栏组织（b）、海绵组织（c）和下表皮（d）组成。对照五味子叶片的叶肉组织显示，栅栏组织排列紧密，细胞壁、细胞质等内含物较多；与对照相比，低温胁迫使叶片厚度变薄，1 ℃和6 ℃胁迫分别处理1 d和2 d时，其栅栏组织变得松散稀疏，内含物变少，染色较浅，以处理1 d 时更为明显；但随着胁迫处理时间的延长，第3 天时，其栅栏组织逐渐恢复紧密状态，内含物较处理前2 天增多；不同温度处理间的叶肉组织结构变化不明显。结果见图1。

图1 ‘嫣红’经低温胁迫后的叶肉细胞结构Fig.1 Mesophyll structure of'yanhong'under low temperature stress

2.2 五味子叶片叶绿素荧光参数及成像变化

Fv/Fm 是PS II 的最大量子效率，反映植物潜在最大光合能力[4]。1 ℃和6 ℃处理 3 d 过程中，在第 2 天1 ℃处理条件下，其Fv/Fm 最低，与对照相比下降了3.8%，由此可见，该参数在低温胁迫过程中变化不大，成像结果差异亦不明显。结果见图2、3。

图2 ‘嫣红’经低温胁迫后的叶绿素荧光参数变化Fig.2 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of'yanhong'under low temperature stress

图3 ‘嫣红’经低温胁迫后的叶绿素荧光成像变化Fig.3 Changes of chlorophyll fluorescence imaging of'yanhong'under low temperature stress

Y（NPQ）是PSII处调节性能量耗散的量子产量，在植物接受的光强过剩时，可以通过调节热耗散来保护机体，是光保护的重要指标。qN 反映了植物耗散过剩光能为热的能力，也反映了植物的光保护能力[6]，该研究中，上述2 个参数变化趋势一致，1℃处理2d的值最高，6℃处理1d的值最低，说明1℃下的光保护能力比6℃时高，其将过剩光能转换为热的能力较高，相比1 ℃处理条件，其对光的需求更低（图2）。Y（NO）指PS II 处非调节性能量耗散的量子产量。若Y（NO）较高，则表明光化学能量转换和保护性的调节机制不足以将植物吸收的光能完全消耗掉。即入射光强超过了植物能接受的程度。这时，植物可能已经受到损伤，或者继续照光植物将受到损伤。Y（NO）是光损伤的重要指标。6℃处理1 d 的Y（NO）最高，说明该条件下的入射光强过剩，在6℃低温处理初始阶段，叶片对光比较敏感（图2）。

rETR为相对电子速率，常被用于反映植物受胁迫程度的指示参数[7]。低温胁迫影响叶片的光合电子传递速率，随着光强不断增大，处理的电子传递速率均低于对照，2 d 1 ℃条件的电子传递速率最低，与PSⅡ趋势一致，说明在该条件下，其光合机构受胁迫最严重。结果见图4。

图4 ‘嫣红’经低温胁迫后的光响应电子传递速率变化Fig.4 Changes of electron transfer rate of'yanhong'under low temperature stress

3 结论与讨论

叶绿素荧光分析技术在植物应答逆境胁迫过程中被广泛用于抗性种质的评价和抗性机理研究，如在番茄[8-9]、高粱[10]、笃斯越橘[11]等植物均有大量报道。研究发现，低温弱光胁迫使甜椒幼苗萎蔫并严重失水[12]。栅栏组织层数少、栅栏组织细胞细长的茶藨属植物比较抗寒[13]。伍宝朵等[14]发现了胡椒叶片厚度随低温胁迫时间延长而降低，栅栏组织和海绵组织细胞随着胁迫时间的延长损伤加剧。较抗寒的黄瓜叶片具有较强的保水力[15]。可见，低温胁迫对植株叶片结构影响较大。在低温处理过程中，五味子叶片厚度变小，在处理1d和2d时，栅栏组织排列整齐度降低，细胞内含物变少；处理3 d 时，叶片栅栏组织恢复紧密状态，说明在零上低温胁迫处理时，五味子叶片经低温胁迫后能逐渐恢复并适应。

Fv/FM与PSⅡ的显著降低说明，低温导致PSⅡ反应中心发生部分失活或伤害。本研究中，五味子经低温处理后，其Fv/FM参数变化与成像变化均不显著，不能指示五味子经低温胁迫后的伤害PSⅡ可指示低温处理植物的实际光合能力和实际光合效率，该值降低后又回升，表明五味子在经历低温初期有抵御能力，能够在一段时间内维持光合效率，超过抵御的临界点，其光合效率就会大幅度降低，随后再升高，植物会有一定的自愈能力，且与胁迫程度有关，因此，该指标可作为筛选五味子抗低温种质的参数。结合荧光参数成像结果PSⅡ、NPQ及Y（NPQ）均能指示出五味子在2 d 1 ℃条件下的变化PSⅡ图像与胁迫程度相关性更大，可以直观地体现五味子受胁迫程度。