禽白血病病毒p27抗原的原核表达及其结合性多肽的筛选

姬向波，张立恒,李新锋，曹天行, ，陈中卫, 3，张春霞,4

(1.河南牧业经济学院 实验研究中心，河南 郑州 450046； 2.河南牧业经济学院 动物医学院，河南 郑州 450046； 3.河南牧业经济学院 动物科技学院，河南 郑州 450046;4.河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室，河南 郑州 450046)

ALV属于α反转录病毒群病毒属成员，可诱发禽类多种良性或恶性肿瘤，易导致感染鸡群免疫抑制、生长抑制等生产性能下降[1]。该病毒主要通过种蛋垂直传播、公鸡精液带毒传播，雏鸡间易发生水平传播，易造成巨大经济损失[2-3]。目前尚无有效的药物和疫苗预防禽白血病，筛选与该病毒主要表面抗原p27的特异性多肽，开发诊断试剂盒，用于诊断该病原具有广阔的发展前景。

噬菌体表面展示可快速地筛选获得高亲和力多肽。Smith(1985)等最早报道将外源基因利用基因工程的方法加入噬菌体的基因组，使外源多肽与噬菌体表面的外壳蛋白共同展示在噬菌体颗粒表面[4]。Scott(1990)等首次实现随机多肽与噬菌体表面蛋白共同展示在噬菌体颗粒表面，建立噬菌体随机展示肽库[5]。噬菌体展示技术与单克隆抗体统制方法相比，具有周期短、成本低等优点。因此，本试验利用噬菌体展示技术，筛选ALV p27蛋白特异性结合多肽，为后期利用多肽制备ALV-p27 ELISA检测试剂盒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Ph.D.噬菌体展示肽库及其宿主菌E.coli ER2738(NEB公司)，表达ALV p27抗原的菌株pET30a-p27为前期构建保存的甘油菌；镍琼脂糖亲和层析柱(中科森辉微球技术有限公司)，蛋白Marker、4S Green Plus核酸染料、IPTG等均购自上海生工，测序和鉴定引物由上海生工合成，Agrose(河南东格生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 ALV p27抗原的制备、浓缩与鉴定

按照参考文献[6]，恒温摇床，20 ℃，220 rpm/min，250 μL 0.5 mmol/L IPTG，1 L pET30a-p27 E.coli菌液，诱导ALV p27蛋白表达；诱导结束后，取菌液4 ℃，12 000 rpm/min，离心20 min，收集细胞菌体沉淀；破碎Buffer重悬后，进行超声波破碎，400 W，20 min(超声2 S，暂停6S为一个循环)；收集破碎后液体，4 ℃，12 000 rpm/min，离心20 min，收集上清；取上清液进行镍琼脂糖亲和层析，经过不同浓度梯度的咪唑洗脱，收集洗脱后的ALV p27蛋白抗原。分别对菌液上清、破碎菌体液、洗涤收集液、洗脱收集液，进行SDS-PAGE电泳。取纯度高的洗脱液进行冻干保存，备用。

1.2.2 ALV p27抗原特异性结合的噬菌体筛选

按照参考文献[6]，无菌条件下，取纯化后的10 μL ALV p27蛋白(0.01 g/L)用100 μL NaHCO3(1 mol/L pH 8.6)包被微孔板，4℃，温和摇荡过夜；弃包被液，用5% BSA液封阻，4℃，8 h；弃封阻液，100 μL(约1×1011滴度)噬菌体肽库加入到相应的孔中，室温温和摇动60 min；每孔加入250 μL 洗涤液(0.1% TBST)，洗涤8次；加入100 μL酸性洗脱液，室温温和摇荡10 min，收洗脱液至含15 μL 1 M pH值为9.1的Tris-HCl缓冲液的离心管内混匀，从中取10 μL测定滴度；将剩余的中性洗脱液加入宿主菌ER2738培养液，37 ℃恒温培养4.5h-5 h；再将培养液于4℃，12000 rpm，离心10 min，收上清，加入1/6上清体积的PEG-NaCl溶液沉淀噬菌体。然后测定扩增以后噬菌体的滴度，重复上述步骤，进行4轮淘选。每轮淘选逐渐降低ALV p27蛋白包被量，以获得高亲和力的噬菌体，将获取的噬菌体单克隆产物进行扩增，保存备用。

1.2.3 ELISA鉴定

取10 μL ALV p27蛋白(40 μg/mL)和10 μL未诱导表达的OB菌培养液上清(40 μg/mL)，用100 μL NaHCO3(1 mol/L pH 8.6)包被微孔板，4℃过夜。PBST洗3次，用2% BSA液，37℃封阻3 h。PBST洗3次，每孔加100 μL噬菌体单克隆抗体(1×1011 PFU/mL)，37℃孵育1 h，PBST洗5次，每孔加 100 μL兔抗M13抗体(封闭液1：8 000稀释)，37 ℃恒温恒湿孵育1 h，PBST洗5次。每孔加100 μL HRP标记的羊抗兔抗体(封闭液1：3 000稀释)，37 ℃恒温恒湿孵育1 h后，PBST洗5次。酶标仪读取450 nm处吸光度OD值。将p27蛋白包被孔中的OD值设为阳性P，OB菌培养液上清包被孔的OD值设为阴性N，挑取P/N > 3的噬菌体单克隆抗体进行扩增。

1.2.4 序列扩增、测序和多肽序列推导

取扩增后的噬菌体2 μL，加入含有20 μL灭菌超纯水，98℃裂解10 min，3 000 rpm/min离心5 min，取上清1 μL为模板，测序引物为5’-GCAAGCCTCAGCGACCGA-3’和5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，PCR扩增测序，产物经凝胶电泳后，取300 bp条带，回收，送上海生工测序。DNA STAR软件推导特异性结合多肽的序列。

2 结果与分析

2.1 ALV p27抗原的制备、浓缩与鉴定

对IPTG诱导物诱导8 h-16 h后的产物，进行离心沉淀，超声波破碎菌体沉淀，沸水煮沸8 min-10 min后，加入10×SDS loading buffer进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可在大约25 KD的位置见到ALV-p27目的蛋白，结果表明，诱导16 h，p27蛋白表达量最高(图1)，将表达蛋白经镍琼脂糖亲和层析柱进行纯化，收集洗脱液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可得纯化后的ALV-p27(图2)。

图1 镍亲和柱层析纯化p27蛋白的SDS-PAGE电泳图M：蛋白标准marker；1：上样液；2：流出液；3：10 mM咪唑洗脱组分；4：50 mM咪唑洗脱组分； 5-6：500 mM咪唑洗脱组分

图2 噬菌体单克隆PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图M：DNA marker；1-8：噬菌体单克隆PCR产物；9：阴性对照

2.2 噬菌体肽库与ALV p27蛋白的亲和性筛选

ALV p27抗原对噬菌体随机M13肽库进行亲和筛选，通过4轮进行亲和筛选，噬菌体克隆抗体回收率从6.9×10-6增加到7.5×10-3，表明目的噬菌体克隆可有效富集(见表1)。

表1 每轮亲和筛选中噬菌体的滴度

2.3 结合性噬菌体单克隆产物的鉴定

挑取噬菌体单克隆产物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，可看到300 bp目的条带。

2.4 测序及其结合性多肽氨基酸序列的推导

ELISA筛选后获得4个噬菌体单克隆产物，PCR扩增后送上海生工测序，测序结果及推导的氨基酸序列(表2)。

表2 噬菌体单克隆的测序结果

3 讨论

噬菌体随机展示肽技术是在噬菌体外壳蛋白基因片段中插入外源多肽基因序列的重组噬菌体技术。利用受体与配体亲和的特性，从噬菌体随机展示肽库中淘选出能与病毒目标抗原结合的多肽，筛选出的多肽与血清中的抗体有高度同源性。王耘等[7]利用竞争洗脱法淘选与Cry3Bb毒素具有亲和力的特异性短肽，以其为结合性受体建立IC-ELISA检测方法。Liu等[8]利用商业噬菌体展示肽库，筛选出可与新烟碱类杀虫剂吡虫啉特异性结合的噬菌体，并以此建立ELISA方法对吡虫啉的最大信号抑制浓度(IC50)和检测限(LOD)分别为96和2.3 ng/mL。本试验运用噬菌体肽库筛选出ALV p27蛋白特异性结合肽具有周期短、成本低等优点。

ALV蛋白质组分主要有gag基因编码的核心蛋白，pol基因编码的3种酶，env基因编码的两种糖蛋白[9]。在gag编码的非糖基化蛋白中，p27是主要的特异性抗原，在病毒复制过程中含量较高，是制备抗体检测的首选抗原[10]。利用噬菌体肽库筛选特异性多肽时，应经过纯化，以防止筛选到与杂质结合的非特异性噬菌体。本试验利用大肠杆菌表达目的蛋白，是体外制备抗原最常用的手段，该方式获取的蛋白产量高、结构简单，且具有良好的抗原性。在小肽与蛋白质的相互作用过程中，氨基酸残基中起重要作用的为其中的5-8个氨基酸残基，或是其中的2-3 个氨基酸残基。本试验选用New England Biolabs公司构建的单链丝状噬菌体随机M13肽库来筛选目标多肽，该展示系统上展示的小肽有 5个拷贝，因而这有利于在筛选过程中获得高亲和力的噬菌体克隆。

现有的商品化ALV-p27检测试剂盒主要利用ALV p27蛋白的单克隆抗体作为包被物，检测待检样品中的ALV-p27抗原含量，再以此来评估样品中的病毒阴阳性。此类试剂盒的ALV-p27抗原单克隆抗体研发周期长，制备费用高。本试验利用噬菌体展示技术很好地规避了这一难题，将ALV-p27抗原在原核细胞中进行表达、纯化，这种与以目标蛋白进行免疫获得蛋白抗体的方法相比更简便，也更易操作。