骨筋丸胶囊质量标准提高研究

唐立海，朱寿光，林蔚文

（广东省东莞市食品药品检验所，广东 东莞 523808）

骨筋丸胶囊由乳香、没药、血竭等14味中药组成，具有活血化瘀、舒筋通络、祛风止痛的功效。目前骨筋丸胶囊沿用的是《中药成方制剂》第十三册标准［1］、《国家中成药标准汇编：骨伤科分册》［2］及相关药品注册标准（国家食品药品监督管理总局国家药品标准 WS3-B-2571-97-3、WS3-B-2571-97-6、WS3-B-2571-97-9、WS3-B-2571-97-12），除个别厂家注册标准有检测血竭含量外，其余均没有检测血竭的含量。在日常抽检检验中发现，市场上大量存在以龙血竭冒充血竭使用的情况。血竭具有活血定痛，化瘀止血，生肌敛疮功效，是骨筋丸胶囊中重要组成成分，目前我国血竭完全依赖从东南亚进口，价格昂贵，质量参差不齐。因此，在骨筋丸胶囊现有的检验标准中增加血竭的含量测定，可以得出企业是否使用伪品投料、少投料、不投料等情况，满足监督生产企业对血竭投料不足或者使用劣质血竭投料等情况。现将结果报告如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号：LC-20A）；色谱柱［资生堂（中国）投资有限公司，型号：MGII，4.6 mm×250 mm，5 μm］。

1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；磷酸等其他试剂为分析纯。

1.3 试药 骨筋丸胶囊 （黑龙江省济仁药业有限公司，批号：180101）；骨筋丸胶囊血竭阴性对照品（陕西君碧莎制药有限公司，批号：20181021）；血竭素高氯酸盐对照品 （中国食品药品检定研究院，批号：110811-201707，含量 96.3%）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的考察

2.1.1 对照品溶液的制备 取血竭素高氯酸盐对照品10 mg，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，加9%磷酸甲醇溶液（取9 mL磷酸，加水定容至100 mL，下同）稀释至刻度，摇匀，再精密量取2 mL置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 检测波长扫描 参照《中华人民共和国药典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量测定”项下的血竭素高氯酸盐的检测波长，测定波长选择定为440 nm。

2.1.3 流动相的选择 《中华人民共和国药典（一部）》［3］2015 年版收载“血竭含量测定”项下的流动相为乙腈-0.05 mol／L 磷酸二氢钠溶液（50∶50）。在此基础上，改变流动相的比例，选择血竭素高氯酸盐分离度、保留时间较适中的乙腈-0.05 mol／L磷酸二氢钠溶液配比（30∶70），实验结果见图 1。

2.2 供试品溶液提取条件的优化 通过比较试验，选定的提取条件为：以9%磷酸甲醇25 mL为提取溶剂，超声处理（功率240 W，频率 40 kHz）30 min。

2.2.1 提取溶剂的选择 实验结果（磷酸甲醇浓度为1%、3%、6%、9%、12%时，面积积分值分别为441 323、534 766、742 861、764 072、765 319）表明：血竭素高氯酸盐的提取效率与提取溶剂中磷酸的浓度有关，当磷酸的浓度从1%逐渐提高至9%时，血竭素高氯酸盐的含量逐渐提高，当磷酸浓度提高至12%时，血竭素高氯酸盐的含量不再提高，同时考虑磷酸甲醇的浓度太高，酸性太强，对仪器与色谱柱有损坏，故选择9%磷酸甲醇作为提取溶剂。同时进样溶液用甲醇进一步稀释，以降低磷酸甲醇的浓度，参照《中华人民共和国药典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量测定”项下的血竭素高氯酸盐的供试品制备方法，拟定用甲醇稀释5倍再上机进样。

2.2.2 提取方式的选择 《中华人民共和国药典（一部）》［3］2015 年版“血竭”的提取方法为“振摇 3 min”，提取时间较短，且对振摇力度和强度未作具体要求。同时，血竭素高氯酸盐存在对热不稳定性，实验结果（加热回流 5、15、30 min，面积积分值分别为701 170、643 005、535 080）也表明：随着加热回流时间的增加，血竭素高氯酸盐的含量逐渐降低。在比较不同超声时间对提取结果的影响，结果（超声提取时间 5、15、30、60 min，面积积分值分别为678 550、708 970、768 535、768 940）表明：超声 30 min和超声60 min的结果一致，说明血竭素高氯酸盐提取完全，考虑实验操作的方便性，因此选用“超声处理（250 W，40 kHz）30 min”的提取方式。

图1 不同比例流动相（乙腈-0.05 mol／L磷酸二氢钠溶液）的HPLC图

2.2.3 样品稀释倍数的选择 供试品上机前的不同稀释倍数，实验结果均一致，考虑稀释倍数过大，峰面积过小，易引起较大误差，因此选用上机前稀释2倍的条件，即“……，取续滤液，再精密量取续滤液5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得”。

2.2.4 不同磷酸甲醇浓度对对照品的影响 实验结果（磷酸甲醇浓度为1%、3%、6%、9%、12%时，面积积分值分别为 535 146、531 677、537 705、538 886、537 243）表明：不同浓度的磷酸甲醇对血竭素高氯酸盐对照品的溶剂及测定无影响，考虑不同酸度对色谱柱的影响，因此选用甲醇稀释至刻度，即“取血竭素高氯酸盐对照品10 mg，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，加9%磷酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取2 mL置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得”。

2.3 理论板数的选择 结合不同色谱柱所测得的血竭素高氯酸盐的理论板数，以及参照《中华人民共和国药典（一部）》［3］2015 年版中的“血竭”，相关中成药含量测定项下的血竭素高氯酸盐理论板数的规定，故理论板数按血竭素高氯酸盐峰计算应不低于3 000。

2.4 分析方法认证 供试品溶液的制备：取供试品研细，每份精密称定0.75 g，置具塞锥形瓶中，精密加入9%磷酸甲醇溶液25 mL，称定重量，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，放置至室温；再称定重量，用9%磷酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；再精密量取续滤液5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

骨筋丸胶囊血竭阴性对照品溶液的制备：取不含血竭的阴性样品0.75 g，余同供试品溶液的制备。

测定法：分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，依法测定，理论板数按血竭素高氯酸盐计算应不低于3 000。

2.4.1 专属性考察 按照上述色谱条件，吸取阴性对照溶液、供试品溶液、对照品溶液，分别注入色谱仪。结果血竭阴性供试对照品溶液的色谱在血竭素高氯酸盐对照品色谱相应位置上无干扰，见图2。供试品色谱主峰与相邻峰分离度大于1.5，符合《中华人民共和国药典（四部）》［4］2015 年版“通则 0512”的有关要求。

图2 血竭素高氯酸盐专属性HPLC图

2.4.2 线性关系的考察 参考文献［5-6］，精密称取血竭素高氯酸盐对照品适量，用9%磷酸甲醇制成每1 mL含血竭素高氯酸盐0.369 022 mg的对照品溶液，再用依次稀释到以下浓度：0.184 511、0.073 804、0.036 902、0.007 380、0.003 690、0.000 738 mg／mL。精密吸取上述对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标、血竭素高氯酸盐量（μg）为横坐标，在 0.007 38～3.690 22 μg 的范围内线性良好，得回归方程为：Y＝1 544 1249.57X＋1 061.53，r＝0.999 9。表明在此范围内线性良好。

2.4.3 精密度试验 取已制备的对照品溶液，每次进样量为10 μL，连续进样6次，得到血竭素高氯酸盐面积的均值为369 335，RSD%为0.4，说明仪器精密度好。

2.4.4 重现性试验 取同一批骨筋丸胶囊样品，按“2.4供试品溶液的制备”项下方法制备6份，分别测定，每次进样量为10 μL，各供试品中血竭素高氯酸盐平均含量为0.49 mg／粒，RSD%为0.6。实验结果表明：本方法重现性较好，方法可行。

2.4.5 稳定性试验 取同一批骨筋丸胶囊样品，按“2.4供试品溶液的制备”项下方法制备，每次进样量为 10 μL，在 0～35 h 内进样 10 次（0、2、4、8、12、16、 22、24、29、35），测得峰面积的 RSD%为 1.2。实验结果表明：供试品溶液在35 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取上述已知含量的骨筋丸胶囊9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入以下对照品溶液（每1 mL含血竭素高氯酸盐0.016 81、0.024 65、0.030 97 mg）各25 mL，按含量测定项下操作，测得平均回收率为99.1%，RSD%为1.3。结果表明：骨筋丸胶囊用本法测定回收率良好。

2.4.7 不同色谱柱的考察 取同一供试品溶液，在不同厂家品牌的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱上测定，厂家分别为：资生堂（中国）投资有限公司，型号：MGII，4.6 mm×250 mm，5 μm；迪马科技有限公司，型号：Diamonsil，4.6 mm×250 mm，5 μm；沃特世科技（上海）有限公司，型号：RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm。 结果：分离度均良好，RSD%为 0.9，测定结果基本一致。

2.5 样品的含量测定 取57批次骨筋丸胶囊，按拟定的含量测定方法操作，测定。总共13个厂家，57个批次，其中有2个厂家4个批次未检出血竭素高氯酸盐（占7.02%），其余53批次检出血竭素高氯酸盐（占 92.98%），含量在 0.02～0.69 mg／粒，其中：23批次含量在 0.02～0.08 mg／粒（占 40.35%），18批次含量在 0.11～0.19 mg／粒（占 31.58%），4批次含量在 0.20～0.28 mg／粒（占 7.02%），1批次含量为 0.38 mg／粒（占 1.75%），4批次含量在 0.40～0.49 mg／粒（占 7.02%），3 批次含量在 0.60～0.69 mg／粒（占5.26%）。含量测定结果批间差异较大，推测骨筋丸胶囊中血竭素高氯酸盐含量受原料药材质量或工艺的影响大。

2.6 限度拟定 根据上述53批样品的测定结果，血竭素高氯酸盐的含量在 0.02～0.69 mg／粒，按《中华人民共和国药典（一部）》［3］2015 年版“血竭含量测定”规定，血竭中血竭素高氯酸盐的限度为1.377%。骨筋丸胶囊处方中，1 000粒骨筋丸胶囊的总投料量为913 g，其中血竭的投料量为27 g，因此每粒骨筋丸胶囊含血竭的量为29.57 mg，参考药典规定的限度1.377%计算，每粒应含血竭素高氯酸盐0.40 mg。血竭是粉碎成细粉填充为胶囊剂，因此在生产过程中的损耗大为减少，同时考虑到保存期等不稳定因素，以药材含量的低限推算所订的限度为 0.30 mg／粒。

3 讨 论

实验过程中，发现提取溶剂随着磷酸浓度（1%～12%）的增加，血竭素高氯酸盐的含量逐渐提高，且当磷酸浓度提高至12%时，血竭素高氯酸盐的含量不再提高。但随着磷酸浓度的增加，血竭素高氯酸盐的不稳定性也随之提高，这可能与血竭素结构含有一个苯并吡喃环有关，这类化合物易受光热、pH值影响，导致苯并吡喃环开环形成相应的查耳酮结构［7］。实验结果表明，用9%磷酸甲醇浓度提取时，血竭素高氯酸盐在35 h内较稳定，满足实验要求。同时，考虑血竭素高氯酸盐存在对热不稳定性，因此采用超声处理方式来提取。通过本研究所拟定的血竭素高氯酸盐定量测定方法与《中华人民共和国药典（一部）》［3］2015 年版“血竭”的测定方法比较，实验结果表明：所拟定的测定方法，血竭素高氯酸盐的含量有了大幅提高。

按拟定的方法对57批骨筋丸胶囊样品中血竭素高氯酸盐的含量进行测定，含量结果显示各批间差异较大（按拟定的不得少于0.30 mg／粒的限度计算，合格率为14.06%，不合格率为85.96%），推测骨筋丸胶囊中血竭素高氯酸盐含量受原料药材质量或工艺的影响大。两个厂家4个批次未检出血竭素高氯酸盐，可能原因是厂家为节约成本，未使用血竭投料或者以龙血竭代替血竭投料。在血竭素高氯酸盐含量测定中，13家生产企业，离散程度较大，批间差异均较大，说明企业血竭来源及工艺均不稳定。同时，同个厂家不同批次间测定结果差异较大，提示其投料量不足，推测有可能是厂家使用劣质血竭或减少投料量所致。

现代药理学研究表明：血竭具有抗炎、止痛、抗痢疾、止泻、止血、抗溃疡、抗菌和抗肿瘤等多种药理活性［8］。近年来，血竭素高氯酸盐作为血竭药材的主要药理活性指标之一［9-10］，在细胞层面上的药理活性逐渐被发现，因此血竭素高氯酸盐含量测定结果的准确性，对骨筋丸胶囊质量控制及疗效评价方面均具有重要意义。综上所述，本研究建立的测定方法，操作简单，实验条件稳定，可有效测定骨筋丸胶囊中血竭素高氯酸盐的含量。