硫酸化银杏叶多糖的制备及对犬细小病毒疫苗免疫增强作用的研究

桑浩田 于忠芳 于成龙 张崇昊 董鹏飞 闫振贵

硫酸化银杏叶多糖的制备及对犬细小病毒疫苗免疫增强作用的研究

桑浩田†于忠芳†于成龙 张崇昊 董鹏飞 闫振贵*

（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271000）

本研究通过水提醇沉淀法从银杏叶干粉中提取粗多糖，经脱色素、除蛋白等处理得到精制银杏叶多糖，利用氯磺酸—吡啶法制得硫酸化银杏叶多糖，其多糖含量为68.6%，蛋白含量为2.59%，硫酸基含量为16.4%，硫酸基取代度为1.74；通过犬的体内免疫实验，研究硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒活疫苗免疫反应的影响。结果表明，硫酸化银杏叶多糖能够不同程度的提高免疫后血清CPV抗体水平和IL-2的含量。由此表明，硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒活疫苗具有免疫协同作用，这为硫酸化银杏叶多糖作为免疫增强剂的开发奠定了试验基础。

硫酸化银杏叶多糖 犬细小病毒 抗体水平 免疫增强

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine-Parvovirus，CPV) 感染引起的高度接触性传染病，主要引起犬急性出血性肠炎或新生犬急性心肌炎，对养犬业危害巨大[1]。目前，针对犬细小病毒病尚未发现非常有效的治疗方法，主要依靠接种弱毒疫苗来预防该病[2]。但是，弱毒疫苗常因母源抗体干扰、免疫原性不强、免疫程序不合理等因素影响导致免疫效果不理想。为此，本试验试图从寻找新型的免疫增强剂为突破口，探索硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒弱毒疫苗的免疫协同作用。

随着近几年对多糖研究的不断深入，作为银杏叶提取物的银杏叶多糖(Ginkgo biloba leaf polysaccharide，GBLP)，其生物学活性也引起了研究人员的浓厚兴趣。银杏叶多糖是从银杏叶中提取出来的水溶性成分，主要由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖醛酸等单糖以α-糖苷键形式连接聚合而成，现已证实其具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性。研究表明，银杏叶多糖可显著增强小鼠腹腔吞噬细胞酸性磷酸酶活性和吞噬鸡血红细胞的吞噬能力，可显著增加荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数，有较强的激活非特异性免疫的功能[3]。有研究发现，一定浓度的银杏叶多糖能提高雏鸡脾淋巴细胞培养上清液中的TNF-α水平和IFN-γ含量，表明银杏叶多糖能提高机体的免疫功能，促进细胞因子的合成和释放[4]。研究表明，经硫酸化分子修饰后，许多中药多糖的免疫调节活性明显增强[5, 6]。因此，本试验拟采用氯磺酸－吡啶法对银杏叶多糖进行硫酸化修饰，通过体内试验进一步研究硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒弱毒疫苗免疫反应的影响，以期为银杏叶多糖的开发和综合利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 犬细小病毒病活疫苗，硕腾公司美国林肯厂产品，证号：外兽药证字(2016)11号。每头份含犬细小病毒NL-35-D株至少107.0TCID50。

1.1.2 试验动物及生物制剂 无过往病史、精神状态良好、体重相近的成年土犬，购自泰安郊区；银杏叶粗多糖，本实验室制备；犬细小病毒抗体(CPVAb)酶联分析试剂盒、犬白介素2(IL-2)酶联分析试剂盒，购自上海恒远生物科技有限公司。

1.1.3 主要化学试剂 乙醇、三氯甲烷、过氧化氢、正丁醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯磺酸、无水吡啶、等均为国产分析纯。

1.1.4 仪器 高速冷冻离心机(型号CR21GII, 日本日立公司)、JA1203A电子天平(上海精天电子仪器有限公司)、电热恒温培养箱(山东潍坊医疗器械厂)、电热恒温水槽(型号DK-8D, 上海精宏实验设备有限公司, 太仓精宏仪器设备有限公司产品)、QL-901漩涡震荡仪(澳门市其林贝尔仪器制造有限公司)、WD-9406B水平摇床(沃德生物医学仪器公司)。

1.2 方法

1.2.1 银杏叶多糖的精制和硫酸化 称取适量银杏叶粗多糖，经Sevage法除蛋白、双氧水法除色素，并进行透析、洗涤等处理后，获得精制银杏叶多糖[7]。将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置盐水-冰浴中，加入吡啶，搅拌，使之充分冷却，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸2~4ml，约30~ 40min滴加完毕，烧瓶中出现大量淡黄色固体即为磺酰化试剂。将磺酰化试剂溶解于DMF，加入精制银杏叶多糖粉末0.5g，室温搅拌10min，45℃水浴4h，反应物于冰浴中冷却，用3mol/L NaOH将pH调到7.0，加入3倍体积95%乙醇，4℃静置过夜，离心分离收集沉淀，用水复溶，流水透析24h，去离子水透析48h，冷冻干燥，制得硫酸化银杏叶多糖。

1.2.2 硫酸化银杏叶多糖总糖和蛋白含量的测定 （1）总糖含量的测定：采用苯酚硫酸法[8]测定银杏叶多糖的的含量。配制葡萄糖标准品溶液，准确称取20mg葡萄糖，用纯水定容至100ml。将标准品溶液进行稀释，得到浓度梯度为30、50、100、150、200µg/ml的系列溶液。准确吸取1.0ml标准品溶液，依次置于5支具塞试管内，然后分别加入0.5ml 5%的苯酚溶液和2.5ml浓硫酸，轻摇混匀，25℃放置20min后，用分光光度计于490nm处测定吸光度值。以标准品溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。银杏叶多糖中糖含量的测定方法与标准品相同，将干燥恒重后的多糖配制成溶液，按照以上方法操作，于490nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算多糖含量。（2）蛋白含量的测定：采用Bradford法[9]测定银杏叶多糖中蛋白含量。用1.0mg/ml浓度的牛血清白蛋白(BSA)标准工作液稀释为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml的BSA标准液。分别取2ml，加入3ml考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，2min后，在595nm下测定其吸光度，绘制标准曲线，并计算其标准曲线回归方程。配置0.5mg/ml的多糖样品溶液，依据上述方法测定吸光度后，代入方程计算样品的蛋白质含量。

1.2.3 硫酸化银杏叶多糖硫酸基含量及取代度的测定 用氯化钡-明胶法。取1mol/LHCl溶解K2SO4使其浓度为1.0875mg/ml，分别吸取该溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20ml，用1mol /LHCl补足至0.2ml，分别加入三氯乙酸3.8ml，氯化钡-明胶溶液1ml和明胶溶液1ml，充分混合后室温静置15min，用分光光度计测定混合液360nm处的吸光值，记录各组氯化钡-明胶组与明胶组吸光值之差，以硫酸根浓度为横坐标，差值为纵坐标绘制标准曲线。将样品溶于1mol/L HCl溶液，配成1mg/ml的溶液，100℃水浴中水解4h。取2份0.2ml水解液，同法测定氯化钡-明胶组和单一明胶组的吸光值，计算两组之差。将测样差值代入标准曲线，得样品溶液中硫酸基浓度S%。按下式计算取代度DS=(1.62×S%)/(32-1.02× S%)。

1.2.4 动物试验 将8只成年健康土犬随机分为实验组和对照组2组，每组各4只。两组试验犬均接种犬细小病毒活疫苗，1头份/只；实验组试验犬在免疫前3d、后3d注射1ml/d硫酸化银杏叶多糖溶液(剂量为15mg/kg)，对照组试验犬在免疫前3d、后3d注射1ml/d生理盐水，作为对照。分别在免疫后的0、7、14d采血，离心后取血清，-20℃冷冻保存。采样前12h内，试验犬禁食不禁水。

1.2.5 血清中CPV抗体含量的测定 按照ELISA检测试剂盒说明进行操作，分往包被的微孔中依次加入待测血清，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的细小病毒抗体(CPVAb)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算血清中抗体(CPVAb)含量。

1.2.6 血清中IL-2含量的测定 按照ELISA检测试剂盒说明进行操作，往包被单抗的微孔中依次加入待测血清，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-2呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算血清中IL-2的含量。

2 结果与分析

2.1 硫酸化银杏叶多糖的制备及测定结果

精制的银杏叶多糖经苯酚硫酸法测定的总糖含量约为68.6%，考马斯亮蓝法测定的蛋白含量为2.59%，表明银杏叶多糖可能是一种蛋白结合型多糖；硫酸化银杏叶多糖的硫酸基含量为16.4%，硫酸基取代度为1.74。

2.2 硫酸化银杏叶多糖对血清CPV抗体水平的影响

由图１看出，试验和对照组血清中CPV抗体水平均在免疫后7d达到高峰，然后开始下降；在免疫后的7d和14d，试验组血清中CPV抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。

图1 硫酸化银杏叶多糖对血清CPV抗体水平的影响

2.3 硫酸化银杏叶多糖对血清IL-2含量的影响

由图2可以看出，实验组外周血中IL-2含量呈现先升高后下降的趋势，在7ｄ达到高峰，然后逐渐下降；在免疫后的7d，实验组血清中IL-2含量显著高于对照组(P<0.05)；而在免疫后的14d，实验组血清中IL-2含量与对照组相比，差异不显著(P>0.05)。

图2 硫酸化银杏叶多糖对血清IL-2含量的影响

3 结论

本研究结果表明，硫酸化银杏叶多糖能够不同程度的提高犬细小病毒活疫苗免疫后血清抗体和IL-2的含量，可见硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒活疫苗有一定的免疫协同作用，这为硫酸化银杏叶多糖作为免疫增强剂的开发奠定了一定的试验基础。

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（2019–10–06）

山东省自然科学基金面上项目（ZR2016CM26）；大学生创新创业项目（201810434076）；

†共同第一作者

S816.76

A

1007-1733(2019)12-0004-03