茄子花药诱导胚状体研究

梁宝萍，王 勇，赵红星，李 艳，姜 俊，段 莹

(驻马店市蔬菜遗传育种工程技术研究中心 驻马店市农业科学院,河南 驻马店 463000)

花药培养是获得单倍体的有效途径之一，缩小育种群体规模和年限，提高选择效率[1]对选育自交系和新品种具有重要意义，已成功应用于育种工作[[2]。用此手段育成的卵圆茄“花海茄二号”是一个优质高产卵圆花培品种。茄子花药培养获得植株途径一般有2条，第一，发育胚状体，直接形成植株；第二，先发育成愈伤组织，愈伤组织上面长生长点发育成植株。通过第一条途径具有生长周期短，获得单倍体效率高，有效避免混倍现象，能长期保持高度的分化能力，遗传上也相对稳定[3]。目前已经有很多种植物通过诱导花药成功培育出了单倍体植株，如甘蓝、烟草等是较易于获得单倍体的植株，而有些如茄子，番茄等顽拗性植株很难获得单倍体植株[4]。茄子再生苗发育途径大多是通过愈伤组织或者愈伤组织再生成胚成苗，而直接通过胚状体途径成苗的很少[5]。

研究茄子花药预处理以及激素种类和配比对茄子胚状体诱导的影响，建立茄子花药胚状体成苗体系，为茄子单倍体育种在生产实践上提供一定的技术支持，应加强研究。

1 材料与方法

1.1 材料

供试栽培品种15个，编号分别为Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9、Q10、Q11、Q12、Q13、Q14、Q15，均由驻马店市农业科学院园艺所提供。2017年3月育苗，4月底定植于试验地。定期疏花疏果，植株保持开花状态，其他常规田间管理。

表1 供试基因型材料

1.2 方法

1.2.1 材料采集 适于茄子花药的诱导时期(小孢子多数在单核期靠边期)，参照张玉苗的研究，采集同一栽培条件下，不同品种的茄子花冠长与花蕾萼基部之差0～2mm[6]的花蕾。

1.2.2 低温预处理 花蕾放入4℃冰箱中进行低温预处理，设置处理时间梯度0、1、2、3、4、5、6、7 d选取有效的低温处理时间。

1.2.3 外植体的消毒和接种 在低温预处理后的花蕾中倒入75%酒精消毒后立即用0.1%升汞消毒6 min，之后 10 min之内用无菌水冲洗4次。放无菌滤纸上，用茄子剥出花药进行接种。

1.2.4 高温处理 花药接种后在36 ℃下暗培养0、2、4、6、8、10、12 d，选取高温诱导最高频率时间；对照为直接放置于25℃黑暗条件下培养，每个处理接种6皿，每皿接种10个花药，重复3次。

1.2.5 变温处理 先低温处理3 d，接种后统一36℃高温培养2、4、6、8 d，每个处理接种6皿，每皿接种10个花药，重复3次。

1.2.6基因型的选择 15个栽培品种花药接种到MS添加激素2,4-D 0.2 mg·L-1、KT 0.2 mg·L-1的固体培养基上，蔗糖3 %；4℃低温处理3 d，比较不同品种出胚能力，筛选出胚率最高的品种。

1.2.7 筛选培养基 在基本培养基MS上，分别附加激素浓度梯度组合2,4-D、KT、NAA共19个，蔗糖浓度为3 %，琼脂6 g·L-1，pH5.8。

1.2.8 胚状体诱导 将消毒后的花蕾在无菌的条件下接种在同1.2.7的诱导培养基上，每个处理接种10枚花蕾，重复3次，直到出胚。观察胚状体产生和分化的条件。

2 结果与分析

2.1 筛选易出胚品种

不同品种的花药接到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1上，观察不同品种出胚率。结果表明，不同基因型材料出胚能力有局限性，在15个基因型品种中只有Q6，Q10具有出胚能力，说明不同品种基因型是影响茄子花药出胚率的重要因素之一[7]。

2.2 胚状体产生对温度的敏感度

2.2.1 胚状体产生对低温胁迫的敏感度 将Q6、Q10接种到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培养基上，低温胁迫对茄子花药培养诱导胚状体有不同敏感度，不进行低温胁迫也能诱导出胚状体，当低温胁迫3 d时胚状体诱导率最高，Q6为0.7%，Q10为0.4%，之后有所下降。结果表明，第一，低温胁迫对茄子花药胚状体诱导有一定的敏感度，第二，茄子诱导胚状体低温最敏感的时间是胁迫3 d。

图1 低温处理对胚状体诱导率的影响

2.2.2 胚状体产生对高温胁迫的敏感度 将Q6、Q10接种到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培养基上，结果显示，高温胁迫提高了出胚率，且Q6高温胁迫6d，出胚率达到最高，出胚率为5%。当高温胁迫天数超过6 d时出胚率急剧下降，12 d时出胚率达到最低，Q10在高温胁迫4 d时出胚率最高，为8%。研究结果表明，第一，高温胁迫对茄子胚状体诱导有所提高；第二，茄子花药对高温处理时间较敏感；第三，Q6与Q10高温胁迫诱导率趋势保持一致，但是胚状体诱导频率最高时间不一致，说明不同品种之间诱导胚状体高温胁迫有差异。

图2 高温处理对胚状体诱导率的影响

2.2.3 变温处理 将Q6、Q10在4 ℃处理3 d后，接种到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1的培养基上，再36℃高温处理,研究结果表明，第一，变温处理出胚率高于高温处理出胚率，第二低温处理和高温处理具有一定的叠加效应。第三，适当的低温处理能提高胚状体诱导率。第四，低温处理(4℃)3 d+高温(36℃)6 d是胚状体诱导的最佳温度和时间，Q6变温处理的最高出胚率为8.9%，Q10的最高出胚率为11.3%。

图3 娈温处理和高温处理对2个茄子花药胚状体诱导率的影响

2.3 胚状体对激素组合处理的敏感度

由表2看出，茄子胚状体产生与激素浓度和配比敏感度密切相关， Q6在培养30 d后产生胚状体，培养10d之后产生绿色分化出子叶的绿苗，移栽成苗。2,4-D 0.2 mg·L-1+KT l mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1的培养基上诱导率最高，为20%，其次是2,4-D 0.2 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1的培养基，诱导率为16%。

3 讨论与结论

雄核在温度胁迫下，细胞代谢机制和遗传表达效应发生改变，发育偏离正常发育途径[8]，转向胚状体发生方向，只有胁迫条件下小孢子胚性化程序才能启动[9]。低温胁迫3 d，然后高温6 d胁迫是胚状体诱导率最高的时间，Q6变温处理的最高出胚率为8.9%，Q10的最高出胚率为11.3%。范适在花药预处理以低温(4℃)处理4d+高温(36℃)处理6d的效果最佳[10]，这与前人的结果相似，说明低温和高温胁迫对胚状体产生有叠加效应，经低温和高温胁迫达到一定程度后能有效改变花药内源激素、蛋白质、mRNA、糖类等含量的变化，进而提高小孢子的生活力[11]。

表2 不同浓度激素组合对Q6胚状体诱导的影响

刘独臣在茄子花药诱导胚状体时，基因型E3低温处理2 d胚状体诱导率高达18%[12]，而也有报道在35℃高温处理2 d获得了5.1%的胚状体诱导率[13]。此次试验中低温胁迫之后，诱导率3 d之后频率最高，基因型Q6和Q10的诱导率仅为0.7%和0.4%，高温处理后，基因型Q6和Q10的胚状体诱导率在6d之后，胚状体诱导率最高，分别为5%和8%。在前人的研究中单独的高温和低温处理都能达到较高得胚状体诱导率，这与前人的研究不一致。这可能是与品种有关，不同品种之间有不同程度的差异。

细胞分裂素和生长素之比反应根和芽的发育，比值高时促进不定芽的分化，反之促进根的形成[14]。2,4-D 0.2 mg·L-1+KT l mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，这种激素组合浓度产生胚状体，诱导效率最高为20%。这说明内源激素加外源激素达到一定平衡才能启动胚状体诱发的能力。三种激素的组合比两种激素组合胚状体诱导率低，有待研究多种激素浓度组合诱导效果。

笔者研究改良了培养条件， Q6和Q10成功获得了胚状体，15个品种中，只有Q6，Q10具有出胚能力。花药产生胚状体频率不高，第一，应进一步研究控制花药培养胚状体产生的有关数量性状基因组合，便于寻找更有效的基因型，从根本上利用花药培养的基因型，促进花药培养的诱导率。