硝酸盐注入方式对抑制硫酸盐还原菌活性的影响*

王大威，张世仑，靖 波，杜 君，景 宏，马 挺

（1.海洋石油高效开发国家重点实验室，北京100028；2.中海油研究总院有限责任公司，北京100028；3.中海石油（中国）有限公司天津分公司，天津300452；4.南开大学生命科学学院分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津300071）

硫酸盐还原菌（sulfate reducing bacteria，SRB）是一类可以利用硫酸盐、硫代硫酸盐乃至单质硫作为终端电子受体的厌氧微生物的总称，以往的研究中所分离的 SRB 约有 18 个属 40 多个种类［1］。SRB也可以在厌氧环境中利用硝酸盐、有机酸等物质生存，广泛存在于油藏、硫黄矿等氧气缺乏的自然环境中［2］。硫酸盐作为SRB生长代谢过程中的电子受体，会在细菌胞内被还原为亚硫酸盐，并进一步还原为硫化氢、硫化亚铁等对生产有害的物质。管道中的硫化氢会引起管道的腐蚀产生恶臭，可能导致维修人员中毒等安全事故［3］，产生的硫化亚铁会污染原油，降低原油品质。在海上油田早期开发生产中，海水常被用于注入油井进行水驱开发，因此大量富含硫酸盐的海水进入油藏，油藏内的SRB即可利用硫酸盐大量扩增，加剧硫化氢的产生和腐蚀问题的出现。

目前，治理SRB 的方法主要包括物理法、化学法和生物法。物理方法包括紫外照射、膜法除盐、机械除渣等，这些方法治理效果较好，但在现场条件下实施较为困难。化学法包括使用氯酸钠等氧化型杀菌剂和季铵盐类等非氧化型杀菌剂。此类方法治理效果明显，但容易造成污染、细菌的耐药性、且成本较高。生物法主要是利用硝酸盐还原菌（nitrate-reducing bacteria，NRB）竞争性抑制SRB 生长的方法［4-10］，也称为生物竞争排斥技术（biocompetitive exclusion，BCX）。该方法具体原理是向油藏内注入低浓度的硝酸盐/亚硝酸盐，相比于硫酸盐，硝酸盐/亚硝酸盐更易成为电子受体，从而促进油藏内存在的NRB大量生长扩增，并与SRB竞争生存空间及底物，阻止SRB 获得所需的生长营养物质，控制SRB的代谢活性。

目前生物竞争排斥技术已经在油藏SRB 治理中得到大量应用，但现场注入工艺一直是影响该技术使用效果的主要限制因素。笔者在室内研究的基础上，以不同注入方式向模拟地层环境中注入硝酸盐，激活NRB 抑制SRB，探索抑制SRB 活性的最佳硝酸盐注入方式。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

地层水取自绥中油田某生产井，离子组成（单位 mg/L）为使用前在12000 r/min、4℃条件下离心20 min，然后在121℃下高压蒸汽灭菌20 min。菌种取自绥中油田某生产井水样，使用SRB 培养基（g/L）（0.5 KH2PO4、1.0 NH4Cl、1.0 Na2SO4、0.05 CaCl2、2.0 MgCl2·6H2O、1.0 酵母提取物（yeast extract）、0.1 抗坏血酸（VC）、0.1 CH3COONa、1.1 d-C3H6O3Na）、NRB培养基（g/L）（0.5 KH2PO4、1.0 NH4Cl、1.0 NaNO3、0.05 CaCl2、2.0 MgCl2·6H2O、1.0 yeast extract、0.1 VC、1.0 CH3COONa）在58℃下培养以富集水样中的SRB 和NRB。培养基中的试剂购自天津希恩思生化科技有限公司、天津科密欧化学试剂有限公司、天津津东天正精细化工试剂厂等化学试剂公司。SYBR Green qPCR Master Mix（绿色荧光染料混合试剂），日本TaKaRa公司；硫酸盐快速检测试剂盒，英国Modernwater 公司；硫酸盐还原菌水质测试瓶SRB-HX，北京华兴化学试剂厂；Axygen 细菌基因组小提试剂盒（Lysis buffer、溶菌酶），美国Axygen公司；NaNO3、十二烷基硫酸钠（SDS），分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

iQTM5 荧光定量 PCR 仪，美国 Bio-Rad 公司；台式高速冷冻离心机，德国Sigma 公司；SpectroDirect分光光度计，德国罗威邦公司；硫化氢检测管，德国德尔格公司。

1.2 实验方法

（1）现场采样

取25 L 干净塑料桶用医用酒精洗2数3 遍，备用；根据井口压力选择性接上高（低）压取样器，打开取样阀，让采出液流出5数10 min 并冲洗塑料桶2数3 遍；将采出液灌满塑料桶（不留空气体积），每口井25 L（其中原油至少1 L，地层水至少10 L），拧紧盖子密闭常温保存（注意冬季防冻结、夏季防暴晒）；样品采集后尽快运送至实验室进行样品预处理。

（2）模拟实验

用地层水将SRB 培养基稀释10 倍，用SRB 测试瓶培养SRB和NRB。以地层水为培养基，灭菌后以1%的接种量接入SRB和NRB，使SRB和NRB的接入量与油藏中的比例相同。设置每日0、20、40、80 mg/L 和每 5 d 100、200、400 mg/L 的硝酸盐注入梯度，根据现场实际注入浓度，研究不同硝酸盐注入浓度、注入方式（每天注入、一次性注入）下，硫化氢浓度、SRB 和 NRB 数量的变化，得到现场的最佳注入方式。

（3）样品DNA的提取和保存

取菌液20 mL 于离心管中，12000 r/min 离心10 min；菌体使用1 mL Lysis buffer 洗两次后，用0.6 mL Lysis buffer重悬并加入0.2 g玻璃珠研磨1 min，重复3次，使用终浓度为10 mg/mL的溶菌酶在37℃下反应1 h，加入120 μL 20%的SDS 在65℃下反应1 h，之后按照Axygen细菌基因组小提试剂盒第5步开始完成后续提取，具体方法步骤参照说明书。

（4）SRB和NRB数量测定

使用实时荧光定量PCR仪进行定量，使用SRB共有基因上游引物dsrF：CAACATCGTYCAYACCCAGGG和SRB共有基因下游引物dsrR：GTGTAGCAGTTACCGCA 对 SRB 进行绝对定量；使用NRB 共有基因上游引物napAF：CTGGACIATGGGYTTIAACCA 和NRB 共有基因下游引物napAR：CCTTCYTTYTCIACCCACAT 对 NRB 进行绝对定量。

（5）培养液中各离子和硫化氢浓度的测定

在 500 mL 油水体系中加入 200、400 mg/L 的抑制药剂（NaNO3），混合均匀后置于58℃恒温培养箱中，定时取样检测和中间产物的浓度，分析模拟油藏条件下，油藏中的SRB、NRB菌群对抑制药剂的代谢速率和特性，为现场注入工艺调整提供技术支持。

2 结果与讨论

2.1 离子浓度的变化

图1 硝酸盐注入方式对硫酸根浓度的影响

图2 硝酸盐注入方式对硝酸根浓度的影响

图3 硝酸盐注入方式对亚硝酸根浓度的影响

2.2 H2S浓度的变化

H2S是SRB作用后的代谢产物，分析H2S浓度可了解SRB抑制效果。由图4可知，对比空白组，加入药剂组（第2数7组数据点完全重合）自始至终没有硫化氢的产生，说明无论每日加药方式和一次性加药方式对抑制SRB产生S2-均有显著的效果。

图4 硝酸盐注入方式对硫化氢浓度的影响

2.3 SRB、NRB菌数的变化

硝酸盐注入方式对SRB、NRB菌数的影响见图5。空白组SRB 菌数在前4 d 持续增长，在第4 d SRB 菌数达到2.89×104个/mL，这正好与图1中第4大量消耗相对应，说明SRB 利用大量增殖，同时也造成浓度下降，此后SRB 开始减少，但由于SRB 浓度尚维持在一定水平的消耗速率并未明显降低，说明体系内的浓度降低后，SRB 因无可用而产生数量上的降低。加药组中，SRB、NRB 浓度均有一定升高，说明加入的激活了体系内的NRB，同时SRB也能优先利用高浓度的而增殖，因此即使在加入药剂条件下，因的浓度变化，SRB数量也会呈现某种程度波动，但因为中间产物的存在及有机碳源等底物的消耗，SRB 浓度总体趋势是下降的，且S2-产出明显降低。对比图5（a）、（b）可见，在加入药剂的第1 d，SRB菌数降低，但随后NRB菌数迅速回升并快速生长，一直到第3 d 生长至顶峰，随后会因为及有机碳源的消耗，造成营养不足开始衰退。

实验结果表明，一次性注入药剂在初期对于NRB 的增殖效果要明显优于每日注入等量药剂的效果，说明在治理初期，体系内有机碳源含量高时，低浓度的无法直接抑制SRB，只有在NRB 存在的情况下，NRB 利用产生才能起到抑制作用，而高浓度大剂量的可以有效地抑制SRB。高浓度可诱导SRB 优先还原并产生中间产物从两个方面抑制SRB，但此时NRB 的存在也会消耗体系内的引发SRB还原的过程。在治理中后期会继续促使 SRB 利用有机碳源还原从而使其没有足够的碳源来还原同时NRB 的存在也会进一步消耗有机碳源，抑制SRB浓度作用更加明显；另外，在SRB受到抑制后，持续加入的效果要优于一次性加入，具体表现为在停药后一次性注入的SRB 反弹速度要高于持续加入，说明大剂量加药在中后期的培养体系中及有机碳源由于在治理前期消耗过快，体系内剩余浓度不足，不能进一步抑制SRB 的生长，从而造成SRB反弹更快，而持续加药的体系，尽管前期抑制效果不佳，但中后期体系内能保持一定的药剂浓度，可持续对SRB产生抑制效果。

2.4 SRB、NRB对N的利用

图5 硝酸盐注入方式对细菌数量的影响

图6 模拟地层条件下微生物对不同浓度的利用性

3 结论