一例猪繁殖与呼吸综合征病的诊断

覃燕灵 董建国 王艳午

（1 广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场， 广西南宁 530000； 2 信阳农林学院， 河南信阳 464000；3 广西农垦永新畜牧集团金光有限公司， 广西南宁 530000）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）引起的猪的一种高度接触性传染病，又称蓝耳病。临床上以妊娠母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄阶段猪只的呼吸道症状为主要特征。该病于1987 年在美国暴发[1]，1996 年郭宝清等[2]首次从北京地区暴发流行病猪的流产胎儿体内分离到PRRSV，2006 年春夏季首次暴发由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly-pathogentic PRRSV,HP-PRRSV）引起的“猪无名高热病症”给我国养猪业带来了极大的经济损害[3-4]。2015 年我国暴发由NADC30-like 毒株引起的PRRS，再次严重打击了养猪业[5-6]。

PRRSV 属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，基因组为单股正链RNA，基因组全长约15 kb[7]。由9 个开放阅读 框（ORF）：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7 组成[8-9]。ORF5 编码的GP5 是PRRSV 的膜蛋白。该蛋白是变异最大的结构蛋白，成为PRRSV遗传变异分析的靶基因[10]。本研究通过对一例猪场的疑似PRRS 阳性病例进行实验室诊断分析，以期为疾病的诊断提供科学的思路。

1 材料与方法

1.1 病料样品采集

2018 年3 月，驻马店地区某猪场疑似PRRS 的猪，采集猪肺脏组织，保存于-20℃备用。

1.2 主要试剂

TRIzol 试剂、dNTP Mixture、DL 2 000 Marker、LA Taq DNA 聚合酶、动物总RNA 快速提取试剂盒来自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 引物设计与合成

参考GenBank 中收录的PRRS 基因组序列，设计扩增ORF5 的引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物序列ORF5-F：ACCACCGCAGCATCA GACTTCGTT（5'—3'），下游引物序列：ORF5-R：CGGCCGCGACTTACCTTTAGAGC（5'—3'），扩增片段长度为760 bp，退火温度为60℃。

1.4 组织总RNA 的提取和ORF5 基因的扩增鉴定

采集病猪肺脏组织，用剪刀剪碎，加入少量无菌PBS 并用研磨器研磨成汁，12 000 r/min 离心5 min，取上清按照试剂盒操作说明提取病料组织总RNA。取6 μL RNA 模 板、 12.5 μL 2 ×FastKing One Step RT-PCR Master Mix、1 μL 25×RT-PCR Enzyme Mix、上下游引物各1.25 μL、RNase-Free ddH2O 3 μL 共25 μL 体系，在仪器内进行扩增。扩增条件为：42℃30 min，95℃3 min；94℃30 sec，60℃30 sec，72℃30 sec，35 个循环；72℃5 min。扩增的PCR 产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 ORF5 基因序列比对和进化分析

将鉴定阳性的PCR 产物进行序列测定，随后将获得的序列与PRRSV 代表毒株用DNAStar 进行序列比对并用Mega 进行进化树的构建。

2 结果

2.1 临床病变

由图1 可知，病猪肺脏组织出现典型的间质性肺炎病变，且肺脏萎缩实变，说明猪只肺脏病变严重。

图1 病猪肺脏病变图

2.2 PCR 鉴定结果

将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示扩增出PRRSV ORF5 基因片段，片段大小为603 bp，说明引起该病的病原为PRRSV。见图2。

图2 PRRSV ORF5 基因的扩增

2.3 ORF5 基因进化树构建

运用软件MEGA6.0 对获得的PRRSV ORF5 基因序列和从GenBank 数据库中下载的23 个国内外参考毒株的ORF5 基因序列构建进化树。结果如图3 可知，驻马店地区流行的毒株为美洲型，属于NADC30-like 毒株。美洲型毒株进一步分为4 个亚群，分别是以VR-2332为代表的lineage5/sublineage 5.1，以NADC30 为代表的lineage1/sublineage1.9，以CH-1a 为代表的subgroup I 和以JXA1 为代表的subgroup III。

图3 PRRSV ORF5 进化树的构建

2.4 ORF5 基因序列必对

利用DNAStar 中的Megalign 软件对扩增的ORF5毒株与5 株国内外代表毒株进行基因序列同源性分析。由图4 可知，ZMD 与欧洲型LV 的核苷酸同源性为61.4%；和美洲型VR-2332 毒株的同源性为85.1%；与经典疫苗株CH-1a 核苷酸同源性为87.1%；和致病性很高的毒株JXA1 核苷酸同源性为85.6%；与NADC30毒株核苷酸同源性最高，为95.9%。

图4 PRRSV GP5 基因序列比对分析

3 结论和讨论

通过临床症状和实验室检测结果分析可知，引起猪场发病的是PRRSV NADC30-like 毒株，该毒株于2015年在中国暴发，随后中国许多地区均发现PRRSV 阳性[11]。河南地区也是发现PRRSV NADC30-like 毒株阳性较早的地区，该病的发生给本地区PRRSV 疫病的防控带来了严重打击。

GP5 蛋白是PRRSV 的主要结构蛋白，它在病毒的吸附和入侵过程中发挥重要作用。GP5 蛋白同时是变异最大的结构蛋白，为此常作为PRRSV 遗传进化分析的靶基因[10]。ZMD 毒株与欧洲型LV 的核苷酸同源性为61.4%；和美洲型VR-2332 毒株的同源性为85.1%，表明ZMD 毒株为美洲型毒株；与经典疫苗株CH-1a 核苷酸同源性为87.1%；和致病性很高的毒株JXA1 核苷酸同源性为85.6%；与NADC30 毒株核苷酸同源性最高，为95.9%，进化树分析显示ZMD 与NADC30 和NADC30-like 毒株位于同一分支，这些结果表明ZMD毒株为NADC30 样毒株。该结果确证该猪场的疫病是由NADC30 样毒株感染引起。