牛磺酸对STZ诱导的糖尿病大鼠伤口愈合的影响

李 伟，姜玉新，陆晓华，王国光

(皖南医学院 1.病理生理学教研室；2.生理学教研室；3.机能实验实训中心，安徽 芜湖 241002)

糖尿病是严重的慢性代谢性疾病，糖尿病足溃疡是糖尿病最严重的血管并发症之一，糖尿病血管病变易引起下肢缺血，导致下肢创面感染和神经病变，进而导致足溃疡的发生[1-2]。糖尿病足溃疡严重影响患者生活质量，给患者家庭和社会带来负担。因此，寻找有效的足溃疡治疗方法有重要的临床意义。牛磺酸是人体内含量最多的非蛋白氨基酸，可改善糖尿病大鼠的心肌损伤[3]，具有调节免疫系统、改善脂质代谢以及抗氧化抗炎等作用[4]。本研究旨在探讨牛磺酸对糖尿病大鼠伤口愈合的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与器材 牛磺酸购自南京建成生物工程研究所；链脲佐菌素(streptozocin，STZ)为Sigma公司产品；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与血小板衍化生长因子(platelet derived growth factor，PDGF) ELSA检测试剂盒购自合肥博美生物工程有限公司；β-actin、VEGF、VEGF受体(VEGF receptor，VEGFR)、p-VEGFR、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、p-ERK、蛋白激酶B( protein kinase B，Akt/PKB)及p-Akt多克隆抗体购自上海生物工程有限公司。

1.2 糖尿病模型复制及分组

1.2.1 实验设计 雄性SD大鼠(体质量200～240 g)购自南京青龙山动物养殖场(许可证号：SCKK2013.0001)。在1周的适应性饲养后，以腹腔注射STZ70 mg/kg，3 d后，尾静脉采血测定大鼠空腹血糖，血糖值超过16.7 mmol/L的为糖尿病大鼠。取16只糖尿病大鼠随机均分为模型组(MOD，8只)及牛磺酸处理组(TAU，8只)，健康大鼠为对照组(CON，8只)。

1.2.2 糖尿病伤口的制备 在造模后两周，大鼠以水合氯醛(10%，0.3 mL/kg)麻醉，剔除后背部毛发，剪切一深至筋膜直径为2 cm的圆形切口。牛磺酸处理组大鼠灌胃给予牛磺酸(100 mg/kg)，辅以伤口牛磺酸软膏处理。对照组及模型组大鼠以凡士林处理伤口。

1.2.3 伤口愈合观察 每天观察伤口的一般状况及愈合情况。并于5、10、15及20 d测量计算伤口创面的愈合率。21 d后处死大鼠，收集血样品及创面的肉芽组织。

伤口愈合率(%)=(伤口初始面积-测量面积)/伤口初始面积×100%。

1.2.4 血管生成因子的测定 血样品离心分离血清，以ELISA试剂盒检测血清中VEGF和PDGF水平，严格遵循试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 伤口肉芽组织的形态学观察 创面肉芽组织以4%的甲醛固定，以石蜡包埋，切5 μm切片。苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，H-E)染色观察肉芽组织的形态学变化，并观察小血管形成情况；马松三色法(Masson trichrome)染色观察胶原及肉芽组织厚度。

1.2.6 肉芽组织蛋白表达分析 创面肉芽组织置于预冷的裂解液中匀浆裂解，在4 ℃下以12 500 g离心20 min。上清液蛋白定量、变性后，在10%SDS-PAGE电泳进行分离，转膜至硝酸纤维素膜。用5%的脱脂奶粉液封闭，分别加β-actin、VEGF、VEGFR、p-VEGFR、ERK、p-ERK、Akt及p-Akt抗体，4℃杂交过夜。洗膜后，与二抗孵育杂交2 h。蛋白印迹以DAB显色。

2 结果

2.1 牛磺酸对糖尿病大鼠伤口愈合的影响 结果显示，在第5天之后，大鼠创面有肉芽组织形成，糖尿病组大鼠创面愈合速率较对照组低(P<0.01)，牛磺酸处理则加快创面的愈合(P<0.01)(表1)。

Groups给药5 d给药10 d给药15 d给药20 dCON13.99±2.3539.44±7.2473.06±8.9791.59±4.99MOD8.03±2.02∗∗25.48±5.13∗∗46.38±7.45∗∗72.18±9.36∗∗TAU10.59±1.66##32.81±5.27##61.54±5.84##84.03±5.04##F时间=665.110,P时间=0.000;F组别=61.554,P组别=0.000;F组别×时间=4.415,P组别×时间=0.001

**P<0.01vs. CON；##P<0.01vs. MOD。

2.2 牛磺酸对血清VEGF及PDGF水平的影响 糖尿病组大鼠血清VEGF及PDGF水平低于对照组(P<0.01)；牛磺酸治疗提高大鼠血清VEGF及PDGF水平，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

GroupsVEGF/(ng/L)PDGF/(ng/L)CON456.61±82.07386.91±52.39MOD331.84±66.26∗∗296.33±45.42∗∗TAU410.51±56.75#363.99±42.71##F6.6598.027P0.0060.003

**P<0.01vs. CON；#P<0.05，##P<0.01vs. MOD。

2.3 创面形态学变化 在切口形成初期，各组大鼠伤口均有炎症出现，糖尿病组大鼠伤口炎症较为严重，且伤口有脓液形成；进一步的组织学观察显示，糖尿病组大鼠的伤口组织有炎症细胞浸润，组织中胶原排列不规则且较为疏松，牛磺酸治疗能改善创面组织中胶原的排列(图1)。

A：H-E染色(400×)，B：H-E染色(1000×)，C：Masson染色(1000×)。

图1 牛磺酸对糖尿病大鼠创面形态的影响

2.4 牛磺酸对相关蛋白表达的影响 糖尿病大鼠肉芽组织中VEGF的表达低于对照组，并且肉芽组织中VEGFR、ERK及Akt的磷酸化水平降低(P<0.01)；牛磺酸治疗增加肉芽组织中VEGF表达，并提高组织中VEGFR、ERK和Akt的磷酸化水平(P<0.01)(图2，表3)。

图2 各组大鼠血管形成信号Western blot图

GroupsVEGF/β-actinp-VEGFR/VEGFRp-ERK/ERKp-Akt/AktCON1.24±0.140.51±0.081.18±0.070.52±0.08MOD0.42±0.06∗∗0.22±0.05∗∗0.42±0.07∗∗0.24±0.04∗∗TAU1.28±0.08##0.41±0.02##0.99±0.09##0.43±0.04##F143.27042.000157.30838.313P0.0000.0000.0000.000

**P<0.01vs. CON；##P<0.01vs. MOD。

3 讨论

糖尿病血管病变是糖尿病并发症如糖尿病肾病、心肌病及视网膜病变的病理基础，也是糖尿病致死和致残的重要因素。糖尿病足溃疡是糖尿病外周血管病变而导致的糖尿病最为严重的并发症。糖尿病足溃疡由于其难于治疗，往往导致截肢而使患者致残，而截肢患者5年的致死率高达70%，严重影响到患者的生活质量，并给患者家庭及社会带来极大的负担[5]。因此，糖尿病溃疡已成为临床医学亟待解决的难题。

大量研究证实，外周血管病变引起下肢缺血易于导致溃疡，进而在溃疡面产生感染，严重缺血时可在溃疡区形成坏疽[6]。促进血管的形成提高伤口的血液供给，有利于创面肉芽的形成，加速伤口愈合。促血管生成因子在调节血管形成中起着重要作用，研究证实，持续的高血糖降低促血管生成因子VEGF的表达，实验研究发现促血管因子可加快糖尿病溃疡创面的愈合[7-8]。本文对大鼠伤口愈合率的计算显示，对照组及牛磺酸治疗组大鼠伤口在实验结束时基本愈合，而糖尿病组则未能愈合，表明牛磺酸具有促进糖尿病大鼠伤口愈合的作用。同时研究还证实糖尿病大鼠血清促血管生成因子VEGF及PDGF降低，创面肉芽组织中小血管数及VEGF的表达均降低，而牛磺酸治疗可提高血清VEGF及PDGF水平及肉芽组织中小血管数量，增加VEGF在创面中的表达。

关键促血管生成因子如VEGF在血管形成中起着重要的作用，其在伤口治疗的实验研究中也表现出促进伤口愈合，然而只显示出短期效应。进一步研究发现是血管形成信号的改变抑制糖尿病伤口的愈合，而不是细胞因子的表达阻碍血管形成[9-10]。Akt和ERK是调节血管形成信号的关键酶，它们通过磷酸化而被激活，激活的Akt和ERK可调节细胞的增殖及存活，并激活促进血管形成的重要酶如一氧化氮合酶[11-12]。本研究发现，牛磺酸治疗可提高伤口肉芽组织中Akt和ERK的磷酸化水平。

本研究结果表明，牛磺酸可提高糖尿病大鼠血清促血管生成因子VEGF及PDGF水平，增加肉芽组织VEGF的表达，并提高组织中VEGFR、Akt和ERK的磷酸化水平，从而促进肉芽组织血管形成，加快糖尿病大鼠皮肤伤口的愈合。