基于高光谱成像的生鲜鸡肉糜中大豆蛋白含量检测

王 伟 姜洪喆 贾贝贝 鹿 瑶

(1.中国农业大学工学院， 北京 100083； 2.中国农业大学现代农业装备优化设计北京市重点实验室， 北京 100083；3.南京林业大学机械电子工程学院， 南京 210037)

0 引言

鸡肉具有低脂肪、高蛋白等特点，是人类膳食营养的重要来源。鸡肉加工时仅依赖自身蛋白质很难形成完好的网络结构，影响其食用品质[1]。大豆蛋白具有良好的吸水性、吸油性、乳化性和凝胶性，适量添加到肉制品中可以改善其色香味等食用品质[2]。目前，国内一些不法商家为了掩盖注水增重等掺假行为，擅自添加大豆蛋白，以增重牟利，却不在添加剂中注明，这不仅严重侵害了消费者权益，也增添了消费者过敏的健康风险[3-4]。一些国家对含肉糜食品，如肉饼、香肠、馅饼等中添加非肉蛋白质是有严格规定的。例如，西班牙熟火腿最多允许添加1%的大豆蛋白，美国对香肠肉丸等肉制品也明确规定了可掺入大豆蛋白的百分比等[5]。研究生鲜鸡肉糜中掺入大豆蛋白含量的检测很有实际意义，肉糜改变了原有的肌肉形态特征，增大了鉴别的难度，因此亟待探索无损检测技术的可行性。

国内外学者对检测肉品或肉制品中大豆蛋白含量的方法进行了诸多尝试，如聚合酶链式反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法、酶联免疫(ELISA)、高效液相色谱(HPLC)等。这些方法操作繁琐且耗时，可以很好地定性鉴别，但定量预测效果并不突出[6-10]。近红外光谱(NIRS)是近些年发展起来、可广泛应用于食品检测领域的无损检测技术，文献[11-13]研究了近红外光谱在原料肉中检测大豆蛋白的可行性，检测结果一般。高光谱成像技术融合了光谱和图像，可以获取目标样品内部生物化学信息和外部的物理结构信息[14-17]，弥补了NIRS方法单点检测的劣势，目前针对鸡肉糜中大豆蛋白含量的检测尚未见报道。

本文采集生鲜鸡肉糜中掺入不同种类、不同梯度大豆蛋白样品的高光谱图像，结合化学计量学算法，建立定量预测模型，并对预测结果进行可视化处理，以探究高光谱成像技术定量检测生鲜鸡肉糜中大豆蛋白掺假的可行性。

1 材料与方法

1.1 样品准备

生鲜鸡胸肉(保存于0～4℃，含水率为70%)采购于北京当地的超市，购买了市场上肉制品中最常用的3种粉状大豆蛋白产品(图1)：大豆蛋白粉(Soybean protein flour，SPF)、大豆浓缩蛋白(Soybean protein concentrate，SPC)和大豆分离蛋白(Soybean protein isolates，SPI)，测量粒度均在125～150 μm之间。SPF(产地河北，食品级，55%)、SPI(产地山东，食品级，90%)、SPC(产地河北，食品级，99%)均购于河北润赢生物科技有限公司。鸡胸肉用刀片切成小块，随后使用国产绞肉机绞碎30 s备用。

图1 3种大豆蛋白粉末Fig.1 Three kinds of soybean protein powder

将鸡肉糜与大豆蛋白分别称量并充分混合，得到总质量为40 g，大豆蛋白质量分数分别为0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%和100%的样品。将样品用叉子依次进行搅拌，以得到近似均质的混合样品。每个梯度下制备8个重复样品分别装入圆形有盖培养皿(直径9 cm，高度1.4 cm)中平铺，最终每种大豆蛋白掺假样本均获得128个样品，贴好标签以备后续高光谱图像数据采集。

1.2 高光谱图像采集与校正

图像采集使用的是推扫式线扫描高光谱成像系统，波段为380～1 012 nm，采集模式为漫反射模式。该系统主要由Image-λ-V10-IM型成像光谱仪(芬兰OULU公司)、Imperx Ltd 型CCD检测器(美国FL公司)、XENOPLAN型可变焦的长镜头(德国Bad Kreuznach公司)、WN500TA1000H型平移台(北京微纳光科公司)、一对Watsonville型500 W卤钨灯(美国CA公司)以及一台安装了高光谱图像采集软件的计算机组成。光谱分辨率为1.9 nm，像素分辨率为0.14 nm/像素，光源分别以与水平方向呈45°角安装于光谱仪两侧，样品表面与镜头表面距离为350 nm，曝光时间设定为32 ms，电动平移台的速度为12 mm/s。由于系统两端光谱区域(380～400 nm和1 000～1 012 nm)信噪比较低，因此仅保留400～1 000 nm(285个波段)光谱范围内的图像用于数据分析。

为了消除CCD相机暗电流影响，需借助白、黑参考图像进行高光谱图像的黑白校正。采集特氟龙板的图像作为白参考，并用镜头盖遮挡相机镜头后采集黑参考图像。并对高光谱图像校正，公式为

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式中Rc——校正后的高光谱图像

R0——未校正前的采集图像

D——采集的黑参考图像

W——采集的白参考图像

1.3 图像处理和光谱数据提取

由于样品与背景之间具有较大的光谱差异，因此肉样部分很容易被识别出来。对700 nm波长(高反射率)下的图像与405 nm波长下(低反射率)的图像进行扣减运算，在波段运算图像(图2a)上以0.25作为阈值，提取大于0.25部分作为样品的感兴趣区域(Region of interest, ROI)，对每一个样品构造掩膜，提取其平均光谱的同时可去除背景、培养皿边缘像素点(图2b)。每个样品中提取ROI的平均光谱作为该样品的光谱，最终得到不同掺假梯度鸡肉糜样品的光谱矩阵。

图2 波段运算后图像与掩膜图像Fig.2 Band math image and mask image

1.4 数据分析方法

图3 不同大豆蛋白含量样品的原始平均光谱曲线Fig.3 Average raw spectra of different soybean protein content samples

2 结果与分析

2.1 原始光谱分析

图3为生鲜鸡肉糜分别掺杂质量分数3%、6%、10%、20%、30%以及100%的3种大豆蛋白(SPF、SPC和SPI)的原始平均光谱。同时，为便于比较掺杂比例引起的光谱反射特征及强度变化，在每幅图中均同时绘制了纯生鲜鸡肉糜的原始光谱，以利于直观比较。

由图3可见，鸡胸肉的反射光谱强度低于3种大豆蛋白粉，具有肌红蛋白(490 nm和560 nm)以及水(760 nm和980 nm)等对应的特征吸收峰/反射谷。当掺杂大豆蛋白含量较少时，例如蛋白质量分数3%、6%和10%(图1a～1c)掺杂样本的光谱峰、谷位置和曲线形状与纯生鲜鸡肉糜的原始光谱基本一致，表明掺杂量较少时光谱特征主要体现的是纯生鲜鸡肉糜。随着掺入蛋白含量的显著增加，如图1d～1f，即分别掺入蛋白质量分数20%、30%、100%时，纯生鲜鸡肉糜的光谱特征逐渐消失，被3类大豆蛋白的在可见光范围较为平滑的光谱特征所取代，3种大豆蛋白粉末在400～1 000 nm波段无明显特征吸收峰，光谱曲线形状相似，而且随着掺杂比例的逐渐增加，掺杂样本的反射率逐渐升高，当蛋白质质量分数为100%时，3类蛋白的反射率均高于纯鸡肉糜，这可能与肉糜中水分逐渐被干蛋白粉吸收有关。进一步研究掺入较高含量3类大豆蛋白的样本(图1c～1f)发现，掺入SPC蛋白与SPI蛋白的肉糜光谱曲线重合度较高，这与两种蛋白自身物质组成相近，即均以高浓度蛋白为主有关；二者均与掺入SPF的光谱曲线存在较大差异，这可能与SPF蛋白含量低、组成成分相对复杂有关。

因此，通过对原始光谱比较可以推测出在鸡肉中掺入逐渐加大梯度的大豆蛋白会造成光谱反射率的逐渐升高以及特征峰的逐渐弱化，这有利于快速准确定量预测鸡肉中不同大豆蛋白的掺假含量梯度。

2.2 全光谱定量模型建立

表1 基于原始及预处理全光谱建立的PLSR模型性能Tab.1 Results of PLSR models based on full raw and preprocessed spectra

2.3 特征波长选取

进一步以优选全光谱模型为基础，应用2DCOS(二维相关光谱)提取特征波长，掺入3种不同大豆蛋白(质量分数0～30%)样品的2DCOS同步谱及其对应的三维立体图如图4所示。在SPF的2DCOS谱图中(图4a)，对角线上产生了6个自动峰(515、617、661、809、871、980 nm)，这些波长点处的微小变化在相应的功率谱(图5)上观测更明显，这说明随着掺入量的增加，这些波段下的反射强度出现了显著变化，因此推断这些波长用来定量分析SPF掺假梯度时是有效的。这些显著变化也反演展示出不同掺假梯度下的样品中颜色变化(515、617、661 nm处)和含水率(980 nm处)有差异[19]。同理，针对SPC和SPI两种大豆蛋白，也用此种方法分别选出了5个波长(图4b、4c)，所有选取的特征波长如表2所示。

图4 2DCOS同步谱等高线图与其对应的三维立体图Fig.4 Wavelengths selection using 2DCOS synchronous contour plots and 3D stereo plots

图5 功率谱Fig.5 Power spectrum

对比掺杂的功率谱(图5)发现，SPC、SPI的功率谱形状相近，而SPF与这两者的功率谱差别较为明显。其原因在于：3种大豆蛋白内部组成不同，大豆蛋白(SPF)为大豆除去油脂后的豆粕直接加工而成，其蛋白质量分数约为43%；而大豆浓缩蛋白(SPC)是去除大豆粉中的低聚糖以及水溶性小分子蛋白，将大豆蛋白中的粗蛋白进一步浓缩所得到，其蛋白质量分数高达70%左右；大豆分离蛋白(SPI)是在大豆浓缩蛋白SPC的基础上，进一步去除掉大分子粗蛋白后得到，其蛋白质量分数更是高达90%左右，因此，相比SPF，SPC和SPI的光谱特征更为接近。其次，SPF功率谱(图5a)所

表2 特征波长选择Tab.2 Summary of key wavelengths selection

呈现的位于可见光范围的特征波长515、617、661 nm处相对峰值较高，是因为SPF蛋白为深黄甚至橙色，相比较SPC、SPI两种蛋白颜色偏深。同样地，SPF功率谱所呈现的特征波长809 nm对应RNH2键，表征SPF中的糖类。因此，当3种蛋白分别掺入生鲜鸡肉糜中时，SPF的功率谱与SPC、SPI明显不同。

进一步分析表2可看出，所有3种大豆蛋白选取特征波长均包含了980 nm，表明无论何种大豆蛋白掺入梯度越高的情况下含水率会越低。除此之外， SPF和SPI样品选取的特征波长都含871 nm，而SPC和SPI样品中选取的波长都含425 nm和572 nm，其他选取出的波长不相同，这表明不同种类大豆蛋白的掺入对整个样品系统的影响具有一定的相似性，又因成分不同具有一定差异。

2.4 多光谱定量预测模型

表3 基于选择波长建立的PLSR模型性能Tab.3 Performance of PLSR models developed by selected wavelengths

2.5 检测限计算

图6 鸡肉糜中掺假大豆蛋白SPF、SPC和SPI检测的简化模型性能Fig.6 Results of simplified models for detection of SPF, SPC and SPI adulteration in minced chicken meat

为进一步观察PLSR多光谱预测模型性能，分别绘制了如图6所示的3种大豆蛋白模型中训练集、交叉验证集和预测集带有误差棒的预测数据与真实数据相关图。检测限(Limit of detection, LOD)是衡量检测方法能力的重要指标，为了评估其灵敏度，本研究中LOD计算公式[20]为

(2)

式中δ——空白样本预测的标准偏差

S——训练集拟合曲线的斜率

由训练集和交叉验证集可以看出，二者检测误差相差较小，表明了模型的可靠稳定性。为了进一步验证检测方法，仅对未参与建模的独立预测集LOD进行了计算，得到应用该方法预测鸡肉糜中SPF、SPC和SPI的LOD分别为0.53%、0.58%和1.02%。可以看出SPF和SPC的LOD均在1%以下，而SPI的LOD在1%左右，现实中以盈利为目的进行的肉类掺假行为掺假率一般都会高于10%，因此使用高光谱成像检测鸡肉糜中大豆蛋白含量是可满足实际需求的，尤其对掺假率在1%以上样品的定量检测效果更佳。

2.6 掺假梯度可视化表征

将SPF、SPC和SPI对应的最优简化PLSR预测模型应用到原始多光谱图像上，针对每一个像素点的大豆蛋白掺入含量进行定量预测，最终拼接成一幅预测分布图。如图7所示，选择了10个掺假梯度(蛋白质量分数0、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%和30%)进行示例展示。可视化图中背景用黑色、低梯度用蓝色，而高梯度用红色表示，可见采用此种线性颜色能够看到不同大豆蛋白梯度下的整体颜色变化，随梯度的升高样品由蓝色向黄红色转变，可清晰看出是否掺假及其掺假水平。样品内各像素点颜色也有差异预示着不同点处的掺假情况也有不同，证实大豆蛋白粉在鸡肉糜中分布也是不均匀的。在SPF和SPC的可视化图中，质量分数为零的样品几乎全是深蓝色，而SPI中质量分数为零与质量分数为2%的样品可视化效果接近，说明该方法对SPF和SPC的定性检测以及微量的定量检测效果要优于SPI，这也与表3中最优模型预测结果相一致。通过构建大豆蛋白掺假梯度可视化分布图的方法，可直观展示与鸡肉颜色相近的大豆蛋白粉的掺入状况，为鸡肉糜的品质安全检测提供了参考。

图7 鸡肉糜中大豆蛋白的可视化分布图Fig.7 Visualization of soybean proteins distribution in minced chicken meat

3 结束语