石河子市区大花金鸡菊白粉病病原鉴定及发病规律

海 艳, 李 妍, 方治豪, 王凯涛, 任毓忠

(石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】大花金鸡菊(Coreopsisgrandiflora)别称大花波斯菊，属菊科(Compositae)金鸡菊属(Coreopsis)植物，原产美洲的观赏植物，我国大部分地区均有栽培，花期较长，其花富含蜜源，并可提取色素。该属植物的主要化学成分具有降脂、降压、降糖、抗氧化及抗炎作用等,也使其应用于药用、食用、工业用途中[1]。目前，白粉病是大花金鸡菊的主要病害之一，白粉病菌主要感染金鸡菊的叶片、茎秆和花器，发生严重时整个植株被白粉覆盖，导致叶片和植株早衰，甚至枯萎死亡，影响金鸡菊观赏价值和生长[2]。【前人研究进展】已报道的能够感染菊科植物的白粉病菌主要有单囊壳属的Podosphaeraxanthii和P.fusca，戈洛文白粉菌属的Govoinomycescichoracearum，白粉菌属的Erysiphearcuata，以及内丝白粉菌属的Leveillulalactucae等[3-8]，Garibaldi等报道了P.fusca是意大利引起金鸡菊白粉病的病原菌，但研究内容主要以病原形态特征的描述及病原鉴定为主，关于病害在不同地区发生规律及具体防治措施的研究鲜有涉及。尤其在新疆，金鸡菊作为新近引进的观赏花卉，病害的研究不够深入。【本研究切入点】2018年5～8月，新疆石河子市区金鸡菊上严重发生白粉病，但目前新疆对金鸡菊白粉病的研究较少，关于病害在当地的发生规律未见报道。研究新疆石河子地区大花金鸡菊白粉病的病原种类。【拟解决的关键问题】鉴定石河子地区金鸡菊白粉病的病原，系统研究病害在石河子市区的发生规律，为白粉病菌的系统进化及病害防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用的金鸡菊白粉病标本于2018年5～8月采自新疆石河子市区明珠河公园内，采集田间表现明显白粉病症状的样本带回室内鉴定。

1.2 方 法

1.2.1 田间症状观察

从田间病害发生初期开始，每隔一段时间观察田间病害的症状变化及病害发生情况，包括发病部位、病斑的颜色、大小、病株的生长状况以及闭囊壳的产生等。

1.2.2 病菌形态学鉴定

将新鲜采集的病样带回室内采用胶带粘帖法观察和测量病菌无性时代的特征；将新鲜病叶用透明胶带在病斑上粘贴后，水做浮载剂，用显微镜(MOTIC BA300)观察和测量菌丝体的形态、分生孢子梗的形状、大小，分生孢子的着生方式、形态、大小等。待病株上产生黑色小点的闭囊壳后，用解剖针挑取闭囊壳，显微观察并测量闭囊壳的形状、大小，附属丝的形态、数量、长度，闭囊壳内子囊的数量、形态、大小以及子囊内子囊孢子的数量、形态、大小等[6,7]。依据观察和测定结果，参照白粉病菌鉴定特征，确定引起新疆大花金鸡菊白粉病的病原[8-10]。

1.2.3 病菌 rDNA-ITS区序列的扩增1.2.3.1 病菌基因组DNA的提取和PCR扩增

将新鲜发病的叶片采集后，室内用干净的毛笔将叶片上的病菌收集后，用BioFlux公司真菌基因组DNA提取试剂盒，提取大花金鸡菊白粉病病原菌基因组DNA。ITS区通用引物为 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'')由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩增 ITS 区片段，电泳观察目标片段的大小[11,12]。

1.2.3.2 病菌rDNA-ITS区序列

将PCR扩增后的目标片段送交上海生工生物工程有限公司进行测序，测序后的结果在NCBI 的 GenBank 核酸数据库中进行 BLAST，获得与该序列同源性较高的ITS区序列，同时通过查阅资料，下载已报道的能引起金鸡菊属或菊科其他植物白粉病的病菌ITS区序列，用Mega6.0 软件进行序列比对和系统发育树的构建。

1.2.3.3 发病规律的调查

从2018年4月18日田间出现病害开始，每隔7 d定点观察白粉病在金鸡菊上的扩展蔓延情况至2018年7月31日，统计田间的发病率及病情指数，病害分级标准以整株叶片平均病斑覆盖率为基础，分级标准如下：

0级:白粉病病斑叶片覆盖率0%; 1级: 白粉病病斑叶片覆盖率0%～25%; 2级:白粉病病斑叶片覆盖率25%～50%; 3级:白粉病病斑叶片覆盖率50%～75%; 4级: 白粉病病斑叶片覆盖率75%～100%。

图1 大花金鸡菊白粉病症状
Fig.1 Symptoms of powdery mildew onCoreopsisgrandiflora

2 结果与分析

2.1 金鸡菊发病症状

金鸡菊白粉病菌主要侵染叶片正面，也可侵染叶片背面，发病初期寄主叶片正面出现白色圆形或无定形絮状斑片(图1-A)，随后逐渐扩大并连成片状白粉斑(图1-B)，由于菌丝体在寄主表面蔓延并且产生分生孢子和分生孢子梗，而寄主叶片受害部位不会迅速死亡，表现出褪绿、变黄；在茎秆、花器上产生白色圆形或无定形斑片逐渐加重形成霉层，后期在叶背面霉层上产生大量的黑色小点，即病菌的闭囊壳(图1-C)，往往在寄主生长后期产生，同时叶正面霉层上分布少量闭囊壳。病菌严重时，白粉斑布满茎秆(图1-D)、花器(图1-E)、整个叶片，更为严重时可导致整个植株死亡。图1

2.2 白粉病菌形态

将发病叶片在解剖镜下观察，闭囊壳呈散生分布；在显微镜下进行形态观察，大花金鸡菊白粉病菌的分生孢子梗直或稍弯曲，无分枝，长度为68.3～97.6 μm(图2-A)，有2～5个分隔，分生孢子串生，椭圆形、长椭圆形、圆筒形(图2-B)，大小为24.4～34.2 μm×14.6～22.0 μm，2～4个分生孢子串生在分生孢子梗上。闭囊壳深棕色、球形或近球形、成熟闭囊壳表面布满凹凸不平的纹路，直径为96.3～139.0 μm(图2-C)，闭囊壳上着生9～15根附属丝，附属丝菌丝状，附属丝长度为73.2～112.2 μm，闭囊壳内只有1个子囊(图2-D)，子囊为双层壁，椭圆形、无色且有柄，大小为68.3～131.7 μm×56.1～80.5 μm (图2-E)，子囊内含8个子囊孢子，子囊孢子形状椭圆形，大小为14.6～26.8 μm×12.2～21.7 μm。其与棕丝单囊壳P.fusca的特征基本一致，引起新疆石河子市区大花金鸡菊白粉病的病原确定为棕丝单囊壳P.fusca。图2

A:分生孢子梗; B:分生孢子; C:闭囊壳和附属丝; D:闭囊壳内单子囊; E:子囊和子囊孢子

A:Conidiophores; B:Conidia; C:Chasmothecia and Appressoria; D: Chasmothecia containing single asci; E:Asci and Ascospores

图2 大花金鸡菊白粉病菌病原
Fig. 2 Morphological characteristics of powdery mildew onCoreopsisgrandiflora

2.3 rDNA-ITS序列的扩增

通过真菌核糖体 ITS 区通用引物 ITS1 和 ITS4，以大花金鸡菊白粉病菌DNA 为模板，PCR扩增大花金鸡菊白粉病菌DNA的 ITS 区，在35个循环后经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测得到563 bp的目的片段。在GenBank核酸数据库中，对大花金鸡菊白粉病菌进行BLASTn同源序列搜索，构建系统发育进化树，发现目的序列(Corecpsis-2)与来自中国大花金鸡菊、佩兰、朝天委陵菜及黄金菊白粉病菌P.fusca( 登录号分别为KM225763、JX546297、KR049083和EU424056)的亲缘关系最近，聚在同一个分支，同源性达到100%，而与来自中国的河西菊上的 Leveillula lactucae( 登录号HQ821500) 亲缘关系最远，同源性仅为88.1%；与寄生于菊科植物上的其他白粉病菌的亲缘关系相对较远。将引起新疆石河子地区大花金鸡菊白粉病的病菌确定为棕丝单囊壳P.fusca。 图3

2.4 发病规律

研究表明,大花金鸡菊白粉病在石河子地区从4月中旬开始发生并在下部叶片上出现症状，随后病情指数迅速上升，至6月下旬达到病害的盛发期，白粉病菌开始为害茎秆、花器，并在6月上旬在被害部位出现闭囊壳，6月底至7月上旬逐渐趋于平稳，7月上旬后随着花期的结束病情指数开始下降，之后金鸡菊平茬后病害逐渐消退，叶片上病斑面积及闭囊壳数量明显开始减少，完成金鸡菊白粉病的季节流行过程。图4

图3 根据ITS序列构建的病原菌系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic analysis based on rDNA ITS sequences

图4 大花金鸡菊白粉病发病规律
Fig. 4 Occurrence regularity ofCoreopsisgrandiflora

3 讨 论

棕丝单囊壳白粉菌(P.fusca)是造成菊科植物白粉病常见的病原之一，在世界各地广泛分布，赵震宇等[8]报道，该病菌在新疆的主要寄主有小蓬属(Nanophyton)、飞蓬(Erigeron.spp)、千里光属(Senecio)、蒲公英属(Taraxacum)、苍耳(Xanthium)、牛蒡(Arctium)、红花(Carthamus)、向日葵(Helianthus)、蓟属(Cirsium)等多种菊科植物[8]。该病菌的侵染可能与地区和寄主密切相关。已报道的引起金鸡菊属花卉白粉病的病原有Erysiphearcuata、P.xanthii和P.fusca[13-15]；金鸡菊作为新疆近几年才引进的花卉品种，对其病原的研究较少，研究中发现的引起石河子市区大花金鸡菊白粉病的病原形态学特征和rDNA-ITS序列分析都与P.fusca几乎完全一致，由此将引起石河子地区大花金鸡菊白粉病的病原菌确定为棕丝单囊壳P.fusca。

白粉病是一种多循环病害，以休眠菌丝、闭囊壳或分生孢子在花卉病株或病残体上越冬，分生孢子借风、雨、昆虫等传播引起病害的多次再侵染造成病害的大面积流行。由于棕丝单囊壳的寄主范围较广，石河子大花金鸡菊白粉病的来源可能有两种，一是来源于疫区种苗的调运，病菌随种苗传入；二是来源于当地的菌源，即病菌借风、雨、昆虫等从附近的其他菊科花卉、杂草等传播到金鸡菊上，造成金鸡菊白粉病的发生和危害。

关于各种植物白粉病的防治关键是对病害发生规律的系统调查和研究，在病害发生初期使用药剂防治依然是目前白粉病防治的关键措施。研究对大花金鸡菊白粉病在石河子市区的发生规律进行了系统的调查，发现该病害在石河子从4月中旬开始发生，5～6月是病害的急速增长期，7月后随着大花金鸡菊的开花结束和休眠病害衰退。对于石河子地区大花金鸡菊白粉病的防治，要在4月中上旬的病害始发期进行。关于病菌在石河子市区的主要越冬场所及菌态、病害的防治措施等将开展进一步的研究。

4 结 论

经白粉菌形态特征观察结合核糖体 ITS 区分析，确定引起石河子市大花金鸡菊白粉病的病原菌为P.fusca，大花金鸡菊白粉病在石河子地区从4月中旬开始表现症状达到始发期；至6月中旬达到病菌的盛发期；7月上旬病情指数开始下降达到病菌的衰退期，完成病害的整个季节流行。