棉酚降解酶及热带假丝酵母ZD-3对棉籽粕脱毒的对比研究

杨文婷 陈 程 张文举

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000）

由于我国畜牧业与饲料工业的快速发展，造成了饲料资源的紧缺，尤其是蛋白类饲料。饲用蛋白质按原料来源可分为动物性蛋白和植物性蛋白。但我国极其缺少如优质鱼粉的动物性蛋白资源，同时动物性蛋白存在一定的安全隐患，所以人们对植物性蛋白原料的应用给予越来越多关注。植物性蛋白不仅来源广泛且价格低廉，主要有大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕等。我国正是产棉大国，棉籽粕资源量排全球第一[1]。棉籽粕中粗蛋白的含量介于菜籽粕与豆粕之间[2]。它是一种优质的植物性蛋白饲料，但由于其含有的游离棉酚（Free gossypol，FG）这一抗营养因子会对动物体产生危害，当动物食用含有较高游离棉酚的棉粕饲料后，其生长、繁殖都会受到很多不良的影响[3-5]，从而限制了它在动物饲养上的广泛应用。目前研究最多的棉籽粕脱毒方法是固态微生物发酵，通常利用单菌或混合菌进行固态发酵[6-10]，被认为是最安全有效的方法。其发酵过程中条件较为温和[11]，经发酵后，棉籽粕品质有所改善[12-15]。目前，从酶学角度进行棉酚酶解脱毒方法的研究尚未报道。本试验研究棉酚降解酶与热带假丝酵母ZD-3对棉籽粕中游离棉酚与营养物质的不同影响，从而评定棉酚降解酶酶解棉籽粕的效果。本试验拟采用棉酚降解酶与热带假丝酵母ZD-3 分别对棉籽粕进行酶解与固态发酵，对比研究棉酚降解酶与热带假丝酵母ZD-3 对棉籽粕中游离棉酚与营养物质的影响，为评价棉酚降解酶酶解脱毒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉籽粕，产自新疆石河子，粉碎，过40目筛，以备后续试验使用。该未经处理的原棉籽粕FG 含量为341.02 mg/kg，经高温高压处理的棉籽粕FG 含量为89.63 mg/kg。

棉酚降解酶，由本实验室通过异源共表达棉铃虫细胞色素酶，获取具有棉酚降解活性的酶蛋白，经验证该酶蛋白作用于棉酚时，棉酚含量会显著性下降，同时棉酚中间代谢物会加速降解，因此将该酶蛋白命名为棉酚降解酶。

棉酚降解酶酶活定义：l mg酶于30 ℃、pH值6条件下，每分钟催化降解1 μmol 棉酚的量为一个酶活力单位，以U/mg 表示。以此酶活定义检测甲醇诱导72 h的细胞破碎上清液蛋白浓度为1.05 mg/ml，酶活为230 U/mg[16-17]。

热带假丝酵母ZD-3为石河子大学饲料生物技术实验室选育保存。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液制备

将热带假丝酵母ZD-3 接入YPD 固体培养基，30 ℃培养48 h，挑取一环菌苔接入5 ml YPD 液体培养基，在试管中30 ℃，150 r/min 摇动培养24 h(一级菌种)，培养时间主要根据菌种的生长情况决定。取1.0 ml 一级菌种接入20 ml 液体培养基，在100 ml 三角瓶中30 ℃，150 r/min摇动培养20 h(二级菌种)。

1.2.2 棉酚降解酶与热带假丝酵母菌对棉籽粕的脱毒效果

称取粉碎后经高温高压处理后的棉籽粕50 g 放入灭菌三角瓶中，分为棉酚降解酶组、热带假丝酵母ZD-3组，以发酵温度、发酵时间、添加量（v/w）(即50 g棉籽粕添加2.5 ml棉酚降解酶或2.5 ml热带假丝酵母ZD-3 菌)、底物水分为脱毒的4 个因素，具体条件见表1，每个处理组设3个重复，以高温高压处理而未经酶解和发酵的棉籽粕为对照组，以未经任何处理的棉籽粕为棉籽粕组。试验结束后，将棉籽粕在电热恒温鼓风干燥箱中烘干48 h，温度为60 ℃，粉碎，过60 目筛，备用。检测游离棉酚含量、粗蛋白含量、粗灰分、酸溶性蛋白含量、中性洗涤纤维及棉籽粕蛋白分子质量分布。

表1 试验各组脱毒条件

1.2.3 FG的测定

采用HPLC 高效液相色谱法测定FG 的含量，精确称取棉籽粕或处理过的棉籽粕0.5 g，加入5 ml 70%丙酮室温超声波萃取30 min，每隔10 min上下翻动一次，混合均匀。静置后收集上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，以备上机检测，具体试验条件参考陈程[16]方法。

脱毒率（%）=(原料中FG 含量-发酵后样品中FG的含量)/原料中FG的含量×100

1.2.4 粗灰分、粗蛋白含量及中性洗涤纤维测定

参考张丽英[18]方法进行粗灰分、粗蛋白含量及中性洗涤纤维的测定。

1.2.5 酸溶性蛋白的测定

准确称取样品0.5 g 于100 ml 烧杯中，准确加入15%三氯乙酸溶液25 ml，混合均匀，静置5 min。以中速定性滤纸过滤，弃去少许初始滤液，将滤液作为备用液。准确移取其上清液10 ml 于消化管中，凯氏定氮法测定蛋白含量[19]。

1.2.6 棉籽粕蛋白分子质量分布的测定

将发酵前后的棉粕取0.5 g，加9.5 ml的蒸馏水混匀后用氨水调节pH值至10.5，过滤，4 000 r/min 离心20 min，加入等体积上样缓冲液，水浴煮沸15 min。取20 μl 液体进行点样。聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）分析棉籽粗蛋白分子量的分布[16，20]。

1.3 数据分析

试验测得的原始数据先采用Excel软件进行初步整理，后用SPSS17.0软件对数据进行分析。

2 结果

2.1 棉籽粕中FG含量的变化(见表2)

如表2 所示，经棉酚降解酶酶解后的棉籽粕，其FG的含量由341.02 mg/kg降到25.01 mg/kg，降解率达到92.67%；经热带假丝酵母ZD-3 发酵后的棉籽粕，其FG 的含量由341.02 mg/kg 降到40.22 mg/kg，降解率为88.21%。相比于对照组73.72%的脱毒率，两个试验组与其差异极显著（P＜0.01），而两个试验组之间差异不显著（P＞0.05）。

表2 不同处理对棉籽粕中FG含量的影响

2.2 棉籽粕中营养成分的变化(见表3)

表3 不同处理对棉籽粕中营养物质的影响(%)

由表3 可知，棉酚降解酶组和热带假丝酵母ZD-3组的粗灰分和酸溶性蛋白相较于原棉籽粕与对照组差异不显著（P＞0.05）；两个试验组的中性洗涤纤维与原棉籽粕差异不显著（P＞0.05），与对照组相比差异显著（P＜0.05）；棉酚降解酶组的粗蛋白含量与原棉籽粕、对照组相比差异不显著（P＞0.05），热带假丝酵母ZD-3 组的粗蛋白含量与原棉籽粕、对照组相比差异显著(P＜0.05)。而棉酚降解酶组与热带假丝酵母ZD-3组各个营养物质的含量之间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 棉籽粕中棉籽粕蛋白分子质量分布的变化

图1 为不同处理棉籽粕中棉籽粕蛋白分子质量分布，由图1可知，SDS-PAGE分析结果表明未检测到经棉酚降解酶酶解及热带假丝酵母ZD-3发酵后的棉籽粕中大分子蛋白质降解成小分子肽的现象。

3 讨论

3.1 棉酚降解酶及热带假丝酵母ZD-3 对棉籽粕中FG含量的影响

当前棉籽粕的脱毒主要利用微生物进行固态发酵，被认为是最安全有效的方法。经前人[6-10]研究能够极显著的降低棉籽粕底物中的游离棉酚，但微生物固态发酵时间过长，从而限制了效率。本试验采取不同处理进行棉籽粕脱毒，结果表明，采用棉酚降解酶进行棉籽粕酶解脱毒可以极显著地降低游离棉酚含量，降解率达到92.67%，其脱毒效果与热带假丝酵母ZD-3 一致（88.21%），而棉酚降解酶酶解脱毒只需2 h，能够极大地缩短时间。综上所述，棉酚降解酶可以很好地替代热带假丝酵母ZD-3用于棉籽粕的脱毒中。

3.2 棉酚降解酶及热带假丝酵母ZD-3 对棉籽粕中营养物质成分的影响

营养成分是评定棉籽粕质量的重要指标。本试验的棉酚降解酶组及热带假丝酵母ZD-3组与对照组相比粗蛋白和酸溶性蛋白均有所提高，中性洗涤纤维和粗灰分有所降低。且棉酚降解酶组与热带假丝酵母ZD-3组相比差异不显著（P＞0.05），因此，棉酚降解酶同热带假丝酵母ZD-3 一样，可以提高酶解后棉籽粕的营养价值，改善棉籽粕源饲料蛋白质品质，从而提高棉籽粕在饲料中的添加比例。

3.3 棉酚降解酶及热带假丝酵母ZD-3 对棉籽粕中蛋白分子质量分布的影响

图1 不同处理对棉籽粕中蛋白质分子量的影响

贾晓锋等[15]利用黑曲霉固态发酵棉籽粕，发现可将高分子量的棉籽蛋白降解为小分子蛋白和肽；常磊[21]筛选出的芽孢杆菌ND-1，灭菌处理的棉籽粕固态发酵后，其大分子蛋白质基本可以得到全部降解。这一变化可能是由于试验所用的黑曲霉及芽孢杆菌ND-1 可以分泌能够降解棉籽粕蛋白的蛋白酶，使棉籽粕中的大分子蛋白质降解成小分子肽类物质。而经检测本试验的两个试验组及灭菌未发酵棉籽粕，均未发现有大分子蛋白质降解为小分子蛋白质，以上结果说明棉酚降解酶和热带假丝酵母ZD-3不具有蛋白酶降解功能。

4 结论

经过研究比较了棉酚降解酶和热带假丝酵母ZD-3 对棉籽粕脱毒的效果，可知由本实验室异源共表达的棉铃虫棉酚降解酶能够有效的降解游离棉酚，提高棉籽粕的营养价值。结果表明：棉酚降解酶对棉籽粕中FG 的降解率达到92.67%，高于热带假丝酵母ZD-3 发酵后的脱毒率。因此，棉酚降解酶酶解脱毒棉籽粕能够替代热带假丝酵母ZD-3 固态发酵方法，同时相较于热带假丝酵母ZD-3 发酵48 h，棉酚降解酶酶解只需2 h，能够极大地缩短脱毒时间，大大提高了棉籽粕脱毒效率。