夜来香根茎多糖超声提取工艺*

张赛男，王妙飞，曾 靖，肖 海，张道英，丁期有

(赣南医学院药学院，江西 赣州 341000)

夜来香(Cestrum noctrnum，Linn)，又名夜香树、夜香花、夜丁香、洋素馨，为茄科夜香树属植物，原产于南美洲[1-2]，现在我国主要分布在南方的广东、广西、福建等地，每年开花约6次。夜来香始记载于《中国高端植物图鉴》[3]，性温味辛，入胃经，有行气止痛镇定[4],镇静催眠[5]的功效，用于治疗胃脘痛。夜来香在民间栽培主要用于观赏、驱蚊和药用[6-7]。其夜间盛开花朵气味芬芳浓郁，常用来调配制成香精；它所含的挥发油成分有驱蚊的作用[8]，所以又经常被制成驱蚊液等。夜来香的化学成分主要有挥发油类、皂苷类、黄酮类、多糖及酚类化合物等。

1 材料、仪器与试剂

1.1植物材料从江西省采集得到夜来香药材。经过赣南医学院程齐来教授的鉴定，是茄科夜香树属植物夜来香(Cestrum noctrnum，Linn)的根茎。取夜来香根茎烘干粉碎过筛后备用。

1.2试剂与仪器D-葡萄糖标准品，购于成都普思生物科技股份有限公司；苯酚、95%乙醇，均为分析纯，购于福晨(天津)化学试剂有限公司；浓硫酸，分析纯，购于西陇科学有限公司。

FWB5中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；BSA224S分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；KQ-500DB数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；101-2-S-Ⅱ电热恒温古风干燥箱，上海跃进医疗器械厂； UV6100PCS紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Exceed-Ad-16艾柯实验室超纯水机，成都艾柯水处理设备有限公司；TDZ4-WS低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

2 方法和结果

2.1多糖的含量测定

2.1.1对照品溶液的制备万分之一分析天平取10.00 mg D-葡萄糖标准品，倒入100 mL容量瓶，倒超纯水至100 mL止，溶解均匀。制得浓度100 μg·mL-1的葡萄糖的标准品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备称取0.50 g夜来香根茎粉末，以1∶40 g·mL-1的物料与液体的比例加入超纯水。30 ℃，超声(500 W，40 kHz)30 min，用超纯水进一步补充失重重量，滤过，向滤液中倒无水乙醇至乙醇浓度为80%，用于醇沉淀。在醇沉24 h后，滤过晾干，所得残余物就是粗多糖。另拿10 mL容量瓶用超纯水溶解粗多糖到其中并倒满10 mL止。取离心试管移入5.0 mL粗多糖溶液。以3 000 r 旋转离心操作10 min，过滤，并继续滤液作为测试溶液。

2.2夜来香根茎多糖含量测定方法的建立

2.2.1溶液的显色准确吸取1.0 mL供试品溶液于10 mL容量瓶中。用超纯水添加到2 mL，移入5%苯酚溶液1 mL，最后加浓硫酸定容到10 mL。显色完成。

2.2.2检测波长的确定取对照品溶液和供试品溶液各1.0 mL，按照显色方法进行显色，显色后扫描波长，葡萄糖对照品溶液和夜来香根茎供试品溶液在490 nm处均有最大吸收波长，所以选择 490 nm为检测波长。

2.2.3标准曲线的绘制精密量取葡萄糖对照品溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，显色后用UV分光光度计测定吸光度，其中，使用0.0 mL对照品作为对照，葡萄糖吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标。绘制标准曲线，得到线性回归方程为：A=0.076 4C-0.009，R2=0.999 6，样品浓度在2.02～12.12 μg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。以葡萄糖对照品吸光度(A)为纵坐标，浓度(C，μg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线见图1。

图1 葡萄糖溶液标准曲线

2.2.4夜来香根茎多糖得率的计算取夜来香根茎供试品溶液1.0 mL，按照显色方法进行显色后测定吸光度，计算多糖的得率。多糖得率(%)=夜来香根茎中多糖质量/夜来香根茎质量×100%。

2.3单因素实验在其他条件均不变的条件下，研究提取温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、提取时间(15 min、25 min、35 min、45 min、55 min)和料液比(1∶20 g·mL-1、1∶30 g·mL-1、1∶40 g·mL-1、1∶50 g·mL-1、1∶60 g·mL-1)对夜来香根茎多糖提取的影响。

以超纯水为提取溶剂，提取时间30 min，料液比1∶40 g·mL-1，不同提取温度对夜来香根茎多糖得率的影响结果见表1。

表1 不同提取温度对夜来香根茎多糖得率的影响

以超纯水为提取溶剂，提取温度为检测结果最优的50 ℃ ，料液比1∶40 g·mL-1，不同提取时间对夜来香根茎多糖得率的影响结果见表2。

表2 不同提取时间对夜来香根茎多糖得率的影响

以超纯水为提取溶剂，提取温度为检测结果最优的50 ℃，提取时间为检测结果最优的15 min，不同料液比对夜来香根茎多糖得率的影响结果见表3。

2.4正交实验优选提取工艺在单因素实验基础上，设计L9(34)正交实验，研究提取温度、提取时间、料液比对夜来香根茎多糖得率的影响。实验因素与水平设计见表4。

由表5可知，各因素对夜来香根茎中多糖得率的影响按大小依次排列，分别是提取温度、料液比、提取时间。多糖最佳提取工艺组合是A3B3C2，即提取温度为60 ℃，提取时间为35 min，料液比为1∶40 g·mL-1，此工艺组合提取的夜来香根茎多糖含量最高。

表3 不同料液比对夜来香根茎多糖得率的影响

表4 因素与水平表

表5 多糖正交实验设计与结果

2.5多糖提取的方法学考察

2.5.1精密度考察精密吸取葡萄糖对照品溶液2.5 mL进行显色，显色完成后立即连续6次测定溶液的吸光度，葡萄糖对照品吸光值RSD 0.32%，说明仪器精密度良好，结果见表6。

2.5.2稳定性考察称取夜来香根茎粉末0.5 g，按照优选的最佳提取工艺进行提取显色，显色完成后立即测定吸光度，之后每隔10 min测一次吸光度，考察70 min内夜来香根茎多糖的稳定性。夜来香根茎供试品显色后在20～70 min内吸光值RSD 0.26%，说明供试品显色后在20～70 min内保持稳定，因此，测定吸光度的时间为显色后的20 min，结果见表7。

表6 精密度考察结果

表7 稳定性考察结果

2.5.3重复性考察称取夜来香根茎粉末0.5 g，按照优选的最佳提取工艺进行提取显色，显色完成后立即测定吸光度，重复试验6次，RSD 1.42%，说明此方法重复性良好，结果见表8。

表8 重复性考察结果

2.5.4加样回收试验称取夜来香根茎粉末0.5 g，按照最佳提取工艺进行提取，得到夜来香根茎待测液。加入和夜来香根茎多糖含量相当的葡萄糖对照品溶液，按照显色方法进行显色，显色完成后测定其吸光度，重复试验6次，计算得D-葡萄糖的平均加样回收率为95.36%，加样回收率的RSD为1.73%，说明此方法测定结果准确可靠，结果见表9。

表9 加样回收试验结果

3 讨 论

在本实验中，超声波辅助提取该属的多糖，充分利用强烈的振动、空化和超声波粉碎，提高该属多糖的提取率。超声波辅助提取与目前的其他多糖提取方法比较，不失为一种简单还高效的方法，不仅可以降低提取时间还可以减少提取成本。同时可以适当降低提取温度，即使提取温度比较低也能达到较高的多糖提取率，可以防止多糖的结果受高温破坏。超声波提取多糖的方法，作为一种良好的提取多糖的方法，已经广泛应用于天然植物中有效成分的提取。另一方面，通过实验结果，还可以获得从该属的多糖超声提取多糖的最佳方法；采用最优工艺进行操作，夜来香根茎多糖得率为18.67%。