射干乙醇提取物抗IBV活性及调控IFN-β表达量作用

向谈婷，刘卫容，方守国

（长江大学农学院，荆州 434025）

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性并具有高度接触传染性的呼吸道疾病，是危害世界养鸡业的主要疫病之一[1-2]。IBV属于单股正链 RNA病毒[3]，血清型多且复杂，目前对该病毒的预防和治疗存在着许多困难[4]。

现代医学表明，在抗病毒上，中草药具有相当优势[5]。射干味苦、性寒、清热解毒、消痰利咽，在临床上应用广泛[6]。射干主要化学成分包括黄酮类和三萜类化合物，其中异黄酮类具有广泛的药理活性[7]。温雯等[8]发现射干提取物对慢性咽炎的治疗作用可能是通过降低血清及肺组织中IgE水平，抑制血清及咽喉组织中IL-4和LTC4的表达来实现。王振飞等[9]证实射干可以抑制肺癌细胞的恶性行为，具有良好的抗肺癌应用价值。刘雨娟等[10]在观察射干对河西走廊地区沙尘所致大鼠慢性咽炎的保护作用时，发现射干阻断沙尘损伤咽部组织的作用机制可能是通过TNF-α受体介导的信号转导途径、下调NF-κB的表达水平而发挥作用。王光函等[11]证明射干提取物能明显降低豚鼠模型BALF中炎性细胞数量，影响细胞因子水平变化，减轻肺组织炎症。目前对射干的研究多集中对咽喉肿痛、咳嗽、气喘等疾病的治疗作用，探究其抗病毒活性的研究甚少。本研究对射干乙醇提取物（简称为提取物）体外抗IBV活性以及对 IFN-β的调控作用进行了研究。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1 材料与方法

1.1 药物中草药射干购于湖北省荆州市第一人民医院中药房，磨碎称重后用一定体积的80%乙醇浸泡7 d以上，初始浓度为0.734 g/mL，离心取上清，用直径为0.22 μm的过滤器过滤除菌备用。

1.2 细胞株与病毒供试细胞H1299（人肺癌细胞系）由新加坡南洋理工大学生物学院病毒实验室惠赠；rIBV由长江大学农学院病毒学实验室成员构建。

1.3 试剂与仪器RPMI-1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco公司；乙醇购自天津市天力化学试剂有限公司产品，分析纯；荧光定量试剂（RR047A）购自TaKaRa公司；IBV-N一抗由新加坡南洋理工大学生物学院病毒实验室惠赠。

1.4 测定最大无毒浓度使用MTT（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法测定最大无毒浓度，参照参考文献[12]。

1.5 RT-qPCR和Western blot检测IBV感染H1299细胞2 h后，提取物处理被IBV感染的H1299细胞，设置病毒加药组、病毒对照组、乙醇对照组、空白对照组，继续培养16～24 h，收获细胞。按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。RT-qPCR实验步骤参照荧光定量试剂盒说明书，反应条件：94℃预变性 30 s，94℃变性 5 s，60℃退火 30 s，40个循环。所用引物序列见表1。Western blot实验步骤：将处理好的细胞样品经SDS-PAGE电泳后，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，经5%脱脂乳封闭，以IBV-N上清为一抗，羊抗兔HRP-IgG（1∶1000）为二抗，通过底物显色进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 MTT检测结果提取物作用16～24 h后，加入MTT在细胞内及细胞周围形成紫蓝色甲臜结晶，利用酶标仪测OD值。当提取物浓度为0.367、0.1835、0.0918、0.0459 g/mL时，OD值与对照组OD值比较差异不显著，不具有统计学意义（P＞0.05），表明该浓度对细胞生长无抑制作用。如图1当提取物的浓度为0.734 g/mL，其OD值小于其他提取物浓度的OD值，差异显著具有统计学意义（P＜0.05），表明仅原始浓度对细胞的生长存在抑制作用，因此将提取物浓度为0.367 g/mL时，确定为最大无毒浓度。

2.2 RT-qPCR检测采用RT-qPCR法对IBV-N和IFN-β基因进行扩增，结果显示（图2A），病毒加药组IBV-N mRNA的表达量低于病毒对照组，差异极极显著，具有极极显著统计学意义（P＜0.001），表明提取物具有抗病毒活性。IFN-β是一种抗病毒因子，病毒侵染细胞后，会引起一系列的免疫反应，促进IFN-β的产生，为进一步探究提取物抗IBV的作用机制，本研究对IFN-β mRNA表达量进行了检测，由图2B可知，病毒加药组IFN-β mRNA的表达量要低于病毒对照组，差异极显著，具有极显著统计学意义（P＜0.01），证实提取物能够调控IFN-β的表达量，推测提取物中含有与IFN-β作用相同的成分，发挥抗病毒作用。

本实验结果说明提取物具有抗IBV活性，但中药的成分复杂，多种有效成分均可作用于不同的靶点、不同环节产生多种药理作用，具体哪一种或哪几种有效成分起到抗病毒作用还有待进一步研究。

2.3 Western blot检测利用抗原抗体的特异性结合，检测病毒N蛋白的表达量，从蛋白质水平检测提取物的抗病毒活性。结果显示（图3），病毒加药组IBV-N蛋白的表达量低于病毒对照组，证明提取物具有抗IBV作用。所得结果与RT-qPCR检测结果一致。

图1 MTT法检测最大无毒浓度Fig.1 The maximum toxic concentration determined by MTT assay

图2 RT-qPCR检测细胞因子的表达（＊＊P＜0.01,＊＊＊P＜0.001）Fig.2 Expression of cytokines detected by RT-qPCR（＊＊P＜0.01, ＊＊＊P＜0.001）

图3 IBV-N蛋白表达量Fig.3 Expression of IBV-N protein