补骨脂不同炮制饮片炮制前后化学成分定性定量分析

陈一龙，郭延垒，励 娜，李胜容，王贤英

重庆市中药研究院，重庆 400065

补骨脂，又名破故纸，来源于豆科植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效[1]。现代研究表明，补骨脂的活性成分主要包括香豆素类、黄酮类、单萜、酚类等[2,3]，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节的药理活性[4]，作为大宗药材，补骨脂已有一千多年的药用历史，由于其生品“性本大燥毒[5,6]”，故千年来临床上多以其炮制品入药。

补骨脂炮制始载于《雷公炮制论》[5]，根据历代炮制沿革，千年来其主要炮制方法有盐炙、盐蒸、酒浸炒、清炒等[7]。在众多的炮制方法中，盐水炒制，因盐可引药入肾，可增强其补肾纳气的作用，加之工艺成本低廉，是补骨脂药材炮制最为常用的方法之一[8]，盐补骨脂饮片也是《中国药典》补骨脂项下所收录的炮制品种。同时，清炒法，即用清水闷润炒制，也是补骨脂常用炮制方法之一，炒炙可通过加热使果实类药物爆裂，易于有效成分的煎出或成分之间的化学转化，从而增强疗效[9]。目前，补骨脂炮制研究多集中在盐炙法上；对于在不同炮制方法下，补骨脂药材炮制前后化学成分变化的报道不多[10- 14]，清炒法炮制前后的成分变化更是未见报道。

本实验首次将补骨脂清炒品进行化学成分分析，并以补骨脂药材生品、相同条件下炮制的盐炙品和清炒品为研究对象，炮制前后高分辨质谱(UHPLC- Q- TOF /MS)定性分析、成分鉴定，并对9个化学成分UHPLC定量分析，结合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS- DA)和Heatmap等统计学方法，探讨不同炮制方法对补骨脂化学成分的影响，从化学成分转化的角度为补骨脂炮制机理研究提供数据支撑，以期更好地保障补骨脂饮片临床用药安全性。

1 仪器与材料

Triple TOF 4600高分辨质谱系统(美国AB SCIEX公司)，LC- 30A超高效液相系统(日本SHIMADZH公司)，AEG- 45SM电子天平(十万分之一，日本岛津公司)，BP121S(万分之一)(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。KQ250DB型数控超声波清洗器(功率250 W，频率40 kHz，巩义市予华仪器有限公司)，BJ- 100多功能粉碎机(德清拜杰电器有限公司)，补骨脂素(psoralen)(批号110739- 200512，中国食品药品检定研究院)，异补骨脂素(isopsoralen)(批号110738- 200309，中国食品药品检定研究院)；新补骨脂异黄酮(neobavaisoflavone)(No.B0012)，补骨脂甲素(bavachin)(No.B0013)，补骨脂乙素(corylifolinin)(No.B0010)对照品均由上海融禾医药科技有限公司提供；补骨脂酚(bakuchiol)(No.B0011)由上海盛中医药化工有限公司提供；补骨脂定(psoralidin)(No.1208/7- 2)，补骨脂宁(corylin)(No.D41004/6- 2)，补骨脂查耳酮(bavachalcone)(No.Z5143/4- 1)对照品均由课题组前期对补骨脂进行成分分离得到；乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Fisher公司)，水为超纯水(杭州娃哈哈公司)，其他试剂均为分析纯(重庆川东化学品公司提供)。

补骨脂药材来源见表1，由重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定为豆科植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL．的干燥成熟果实，样品保存在重庆市中药研究院(见表1)。

表1 补骨脂药材样品来源表

2 方法

2.1 补骨脂不同炮制饮片的制备

盐炙饮片：基于课题组前期对补骨脂盐炙工艺的优化[15]，将2.10 g盐加入适量水中溶解后，加入100 g补骨脂药材中，混匀后闷润12 h，在80 ℃下炒制30 min，取出，冷却至室温，即得盐炙补骨脂饮片。

清炒饮片：在100 g补骨脂药材中，加入适量水，混匀后闷润12 h，在80 ℃下炒制30 min，取出，冷却至室温，即得清炒补骨脂饮片。

2.2 对照品溶液的制备

精密吸取9种对照品储备液适量，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，即得含补骨脂素0.326 mg/mL、异补骨脂素0.165 mg/mL、新补骨脂异黄酮0.371 mg/mL、补骨脂甲素0.168 mg/mL、补骨脂乙素0.390 mg/mL、补骨脂酚5.055 mg/mL、补骨脂定0.213 mg/mL、补骨脂宁0.743 mg/mL、补骨脂查耳酮0.032 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

分别取补骨脂生品药材、清炒及盐炙饮片粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取2 h，放冷，转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4 定性分析质谱条件

UHPLC色谱条件：选用Kinetex XB- C18柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)，流动相为含0.1%甲酸水(A)/乙腈(B)，采用梯度程序：0～1.0 min,10% B；1.0～8.0 min；10% B～80% B；8.0～12.0 min,80% B；12.0～12.1 min，80% B～10% B；12.1～15.0 min，10% B。流速300 μL/min，柱温为30 ℃，进样量3 μL。

质谱条件：Triple TOF 4600高分辨质谱系统采用ESI离子源，采用Positive离子化方式；质量扫描范围m/z100～1 000；鞘气为55 Psi，辅助气为55 Psi，气帘气为25 Psi，雾化温度600 ℃，采用TOF- MS- Product Ion- IDA扫描模式，TOF/MS一级预扫描和触发的二级扫描Product Ion- IDA离子累计时间分别为250和100 ms，采用多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS)作为二级触发条件，解簇电压40 V，CE碰撞能量为35 eV，CES碰撞能量叠加为35±15 eV。

图1 补骨脂正离子模式下总离子流色谱图Fig.1 UHPLC- Q- TOF/MS total ion chromatogram of P.corylifolia in positive ion mode注：a生品，b盐炙品，c清炒品。Note:a:crude product,b:stir- fried product with salt,c:stir- fried product.

2.5 定性测定与数据分析

采用2.4中色谱质谱条件，分别对2.2中对照品溶液和2.3中样品溶液进行正离子模式采集(见图1)，所得数据采用PeakView进行数据分析。根据各色谱峰的二级碎片裂解规律，通过Formula Finder，结合文献报道、数据库和对照品比对，对补骨脂不同炮制饮片进行化学成分鉴定。

2.6 定量分析液相色谱条件

在课题组前期研究基础上[15]，得到补骨脂UHPLC色谱条件：色谱柱为Shim- pack XR- ODS III色谱柱(50 mm×2.0 mm，1.6 μm；S/N 11122273)；检测波长246 nm；柱温45 ℃；进样量4 μL；以乙腈- 0.2%冰醋酸水溶液为流动相，0.4 mL/min体积流量，梯度洗脱，见表2。分别对2.2中对照品溶液与2.3中样品溶液进行测定，得到UHPLC数据，见图2。通过MeV4.9.0将得到数据绘制Heatmap图，进行含量变化的直观分析；在通过SIMCA13.0进行无监督模式的主成分分析(PCA)和监督模式下正交偏最小二乘映射(OPLS- DA)分析。

表2 梯度洗脱表

图2 补骨脂液相色谱图Fig.2 UHPLC Chromatograms of P.corylifolia 注：A：混合对照品，B：生品，C：盐炙品，D：清炒品。1补骨脂素，2异补骨脂素，3新补骨脂异黄酮，4补骨脂甲素，5补骨脂定，6补骨脂乙素，7补骨脂宁，8补骨脂查尔酮，9补骨脂酚。Note:A:mixed reference standard,B:crude products,C:stir- fried products with salt,D:stir- fried products.1 Psoralen,2 Isopsoralen,3 Neobavaisoflavone,4 Bavachin,5 Psoralidin,6 Corylifolinin,7 Corylin,8 Bavachalcone,9 Bakuchiol.

3 结果与分析

3.1 补骨脂不同炮制方法前后成分UPLC- Q- TOF/MS定性分析

补骨脂生品、清炒品和补骨脂盐炙品中的化学成分在ESI正离子模式条件下均具有较好的响应，采用PeakView1.2从一级质谱图拟合元素组成可获知该化合物的分子式信息，再结合网络数据库HMDB和MassBanK等网络数据库，分析质谱裂解规律[16、17]，可推测出各化合物的结构，本实验共鉴定出38个化学成分(见表3)。比较补骨脂生品、清炒和盐炙三种炮制品的总离子流图轮廓，清炒品和盐炙品较相似，而补骨脂生品与炮制品(清炒品、盐炙品)比较变化较大，化合物[M + H]+233.117 7m/z，[M + H]+235.094 7m/z，[M + H]+399.143 3m/z(补骨脂新异黄酮)，[M + H]+352.094 3m/z，[M + H]+177.127 5m/z在生品和清炒品均有检测到，而盐制品中则没有，5个成分中鉴定出其中一个为补骨脂新异黄酮。以补骨脂酚为例，补骨脂酚的裂解主要在烃基支链上，分子离子为[M + H]+257.188 4m/z(见图3)。

表3 补骨脂不同炮制饮片中化合物的鉴定

续表3(Continued Tab.3)

编号No.化合物Compound分子式Formula加合离子Adduct误差Error(ppm)保留时间tR(min)分子离子MS二级碎片MS210Corylifol BC20H20O5+H0.47.17341.138 5269.079 9,203.069 8,149.023 111PsoralenolC20H18O5+H0.47.17339.122 8321.111 2,267.065 6,239.070 4,137.023 312PsoralenC11H6O3+H1.97.56187.039 3131.048 513Corylifol CC20H18O5+H0.47.61339.122 8283.059 6,211.038 814Psoracorylifol DC18H24O2+H0.27.65273.185 0255.173 8,147.079 6,107.049015IsopsoralenC11H6O3+H1.97.72187.039 3131.049 516Isoaromadendrene epoxideC15H24O+H1.47.91221.190 3203.179 8,147.116 6,119.084 2,105.069 317BavachinC20H20O4+H0.68.09325.143 7269.080 3,149.022 818BakuchalconeC20H20O4+H0.48.25341.138 5269.080 2,203.070 1,149.023 519Neobavaisoflavone(B8)C20H18O4+H0.18.41323.127 8267.064 8,255.064 7,239.070 4,199.075 520IsobavacninC20H20O4+H0.68.65325.143 7269.080 3,205.085 8,149.023 221PsoralidinC20H16O5+H0.48.85337.107 2319.095 1,203.069 322Erythrinin AC20H16O4+H0.99.19321.112 4279.064 9,263.069 5,137.022 7238-PrenyldaidzeinC20H18O4+H0.19.27323.127 8267.065 8,203.07 1,147.044 324Biochanin AC16H12O5+H-0.29.39285.075 7165.018 22512-OxoisobakuchiolC18H22O2+H1.49.42271.169 6107.048 626CorylifolininC20H20O4+H0.69.72325.143 7269.080 3,149.023 0272,3-EpoxybakuchiolC18H24O2+H0.29.86273.185 0185.094 7,107.048 428Linoleic acidC18H32O2+H0.49.95281.247 6263.237 3,175.147 6,147.115 3,119.084 329Sophoracoumestan AC20H14O5+H010.10335.091 4292.072 2,248.082 230BavachalconeC21H22O4+H0.410.14339.159 2271.096 3,219.101 3,147.044 231Corylifol AC25H26O4+H-0.310.19391.190 3267.064 1,239.069 5,137.023 132PsorachromeneC20H18O4+H0.110.55323.127 8203.070 1,147.043 8 33Psoracorylifol EC18H24O2+H0.210.55273.185 0121.064 7,107.048 434Alpha-linolenic acidC18H30O2+H0.510.63279.232 0201.046 5,149.022 7354′-O-MethylbavachalconeC21H22O4+H0.411.30339.159 2271.096 3,219.101 3,147.044 236NeocorylinC25H24O4+H0.211.98389.174 8321.111 4,267.064 7,137.023 037CalameneneC15H22+H2.513.17203.179 9147.115 8,133.100 2,119.084 7,105.069 138BakuchiolC18H24O+H0.913.68257.190 2173.095 9,121.064 2,107.048 9

3.2 补骨脂不同炮制饮片中9种化学成分定量分析

3.2.1 9种成分UHPLC- DAD测定结果

9个对照品、补骨脂生品和盐炙品色谱图与含量测定数据来源于课题组前期补骨脂研究论文[15]，清炒品数据为首次报道，补骨脂不同炮制饮片9种成分含量(%)见表4。

3.2.2 炮制前后9种成分变化分析

3.2.2.1 Heatmap图分析

将表3中数据用MeV4.9.0制图，得到Heatmap图，通过颜色区域的变化，可以非常直观的呈现复杂数据集数据变化的特点。从图4可见，9种成分中大多在炮制以后(清炒和盐炙)，含量均呈现出上升趋势，可见炮制品区域颜色较生品区域颜色明显不同。

3.2.2.2 清炒组、盐炙组与生品组Dunnett’s multiple comparisons test分析

通过GraphPad Prism 6 进行数据分析，将清炒组、盐炙组分别与生品组的总体样本、和各成分样本进行Dunnett’s multiple comparisons test比较。结果PCrude vs Stir- frying=0.028 4，PCrude vs Salt=0.009 1，说明清炒组与生品组、盐炙组与生品组存在显著性差异，且盐炙组与生品组对比显差更明显(见图5图例)。

图3 补骨脂酚二级质谱图Fig.3 MS2 of bakuchiol

表4 补骨脂中9种成分的含量百分数(n = 3)

续表4

编号No.补骨脂素Psoralen异补骨脂素Isopsoralen新补骨脂异黄酮Neobavaisoflavone补骨脂甲素Bavachin补骨脂乙素Corylifolinin补骨脂酚Bakuchiol补骨脂定Psoralidin补骨脂宁Corylin补骨脂查尔酮Bavachalcone清炒AF(Stir-fry AF)2.1140.4940.6580.1500.3584.9730.3350.3840.150清炒AX(Stir-fry AX)3.4700.6610.4390.0980.2554.0200.3550.2340.109清炒YJ(Stir-fry YJ)1.9270.4290.8100.2310.4235.3180.4150.4860.143清炒AB(Stir-fry AB)2.8590.6530.3990.1140.2983.6490.3700.3770.109清炒YQ(Stir-fry YQ)0.4080.0910.2650.0600.1362.1280.0910.2440.047清炒SA(Stir-fry SA)1.9180.4741.0840.3440.5727.2090.5520.8060.211盐制ZB(Salt-ZB)1.7650.3930.7220.2250.4125.0860.3920.4840.122盐制YZ(Salt-YZ)4.4271.0010.6210.1800.3606.1140.4440.6040.179盐制YT(Salt-YT)4.4601.0140.5820.1730.3495.6710.4470.5980.154盐制SY(Salt-SY)2.3350.4720.7000.2040.4315.0640.4170.5310.160盐制AZ(Salt-AZ)3.4250.6460.4070.0980.2593.8480.3520.2290.106盐制YA(Salt-YA)1.8240.3671.2310.3630.5787.1760.4240.6610.190盐制AF(Salt-AF)2.0420.4520.6660.1640.3725.1910.3520.3980.150盐制AX(Salt-AX)3.6400.6770.4590.1120.2824.4280.3820.2580.107盐制YJ(Salt-YJ)1.7790.3750.5940.1750.3203.9870.3340.3940.102盐制AB(Salt-AB)2.8250.6380.3550.0960.2733.4430.3830.3430.113盐制YQ(Salt-YQ)1.4790.3200.9850.2310.5268.0440.3370.9700.153盐制SA(Salt-SA)1.4250.3280.7940.2670.4285.1630.4430.6570.131

图4 补骨脂不同饮片9种成分含量热图Fig.4 Heatmap of 9 constituents contents in Psoralea corylifolia

3.2.2.3 9种成分Dunnett’s multiple comparisons test分析

9种成分炮制前后柱状图可见，除清炒品中补骨脂宁和补骨脂酚在炮制以后含量有所下降外，补骨脂炮制品(清炒品和盐炙品)中其他成分含量均有所上升；其中增幅最大的为补骨脂素，炮制后含量增涨了近4倍，新补骨脂异黄酮在炮制后也增长了1倍多(见图5A)。Dunnett’s multiple comparisons test比较发现，从含量方面，补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂查耳酮在两种不同方法炮制后的含量均与生品组有显著性差异，而补骨脂定含量仅在盐炙后与生品组比较有显著性差异。

3.2.2.4 3大类成分Dunnett’s multiple comparisons test分析

将上述定量的9种成分按香豆素类(补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定)、黄酮类(新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂宁、补骨脂查尔酮)、和萜类(补骨脂酚)比较(图5B)，除清炒饮片中萜类成分，即补骨脂酚在炮制以后含量有所下降外，不同炮制法制成的补骨脂饮片香豆素类和黄酮类成分含量均有所上升；其中香豆素类成分炮制后含量增幅最大，其含量增长了近1倍。Dunnett’s multiple comparisons test比较发现，两种不同方法炮制后的香豆素类含量均与生品组有显著性差异。

图5 补骨脂不同饮片成分含量分析Fig.5 Contents of constituents in P.corylifolia注：A 不同饮片中9种成分含量，B 不同饮片大类成分含量。*表示有差异， **表示有显著性差异。Note:A:contents of 9 constituents in P.corylifolia,B:contents of categories of chemical constituents in P.corylifolia.* Difference,** significant difference.

3.2.3 化学模式识别法分析

通过模式识别对补骨脂3个炮制组别、9种化学成分含量进行分析，前3个主成分贡献率为91%(PC1 = 56.9%，PC2 = 26.1%，PC3 = 7.9%)。PCA得分图显示(图6A)，从空间投影距离和重叠程度了可见，所有样本可分为两簇：经过炮制的饮片，盐炙与清炒混合在一起，聚成一簇，表明经过炮制的饮片化学成分的构成结构比较相近；而未经炮制的生品则与炮制过的饮片相距较远，能单独聚成一簇，表明炮制前后补骨脂的化学成分组成结构存在较为显著的差异。

无监督的PCA模式分析后，将生品分为一组，炮制品(盐炙和清炒)分为一组，去掉偏离较大的点Crude- YQ、Salt- YJ、Stiring- fry YQ，进行OPLS- DA分析(图6B)，以等方差法(UV,unit variance)为权重，参数为R2X= 0.98，R2Y=0.97%，Q2=0.94。补骨脂生品、清炒品和盐炙品明显聚成两簇，未经炮制的生品聚为一簇，炮制后的聚成一簇。VIP值(图6D)显示成分补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂定和补骨脂查耳酮的含量对补骨脂生品与炮制品(盐炙与清炒)的区分影响最大。

4 讨论

4.1 补骨脂炮制后化学成分变化

本实验在定量分析中，结合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS- DA)模型和Heatmap等统计学方法进一步分析炮制前后含量变化，发现PCA和Heatmap的结果一致，补骨脂生品与炮制品(盐炙和清炒)在化学成分轮廓上存在明显差异；OPLS- DA筛选出的影响分组的差异标志物为补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂定和补骨脂查耳酮。这与统计分析Dunnett’s multiple comparisons test检验结果一致，补骨脂生品与炮制品有显著性差异，其中各成分中，有显著性差异的也是补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂定和补骨脂查耳酮。

本实验定量分析的9个成分均在补骨脂药材中含量较高，且被报道具有生物活性[18，19]。从定量数据上面看，除清炒品中少量成分(补骨脂宁、补骨脂酚)在炮制后含量有所下降外，不同炮制法制成的炮制品，在炮制后含量均有所上升，含量最大增幅为生品的4倍(补骨脂素)，新补骨脂异黄酮含量增长1倍，补骨脂酚和补骨脂宁则不同程度的减少。推测原因为在炮制过程中，上述成分的化学结构发生相互转化造成。补骨脂素增加的原因，推测为补骨脂酚可以环合转化为补骨脂素[14]，见图7A。新补骨脂异黄酮含量增加可能是由补骨脂宁转化而成，见图7B。上述推测可阐释炮制(“闷润”和加热“炙”)工艺，使一些成分的化学结构发生转化[20]，导致药材中具有生物活性的成分含量增高，或生成了某些具有活性的功效成份。上述推测还需通过示踪法，进行进一步的炮制、药理、药效等实验来进行验证。

图6 补骨脂3个样品化学成分化学模式识别法分析Fig.6 Analysis of chemical constituents in P.corylifolia by chemical pattern recognition 注：A：PCA分析得分图，B：OPLS- DA分析得分图，C：OPLS- DA分析载荷图，D：OPLS- DA分析VIP值。Note:A:score Scatter Plot of PCA,B:score Scatter Plot of OPLS- DA,C:loading Scatter Plot of OPLS- DA,D:VIP plot of OPLS- DA.

图7 补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂酚和补骨脂宁的转化途径Fig.7 Transformation pathway of psoralen,neobavaisoflavone,psoralidin,corylin注：A：补骨脂酚转化补骨脂素途径，B：补骨脂宁转化新补骨脂异黄酮途径。Note:A:pathway of psoralen turn into psoralenol,B:pathway of corylin turn into neobavaisoflavone.

4.2 补骨脂盐炙与清炒分析

从本实验结果来看，补骨脂生品与炮制品(盐炙和清炒)在化学成分轮廓上存在差异，可用化学识别模式将生品与炮制品区分开，说明不同“炙”法炮制对其化学成分轮廓影响的关键可能在于加热。从化学成分角度，一定程度上佐证了补骨脂“性本大燥毒”，临床沿用历史上均以炮制品入药为主。

同样是炙法，清炒与盐炙的区别在于是否加盐，传统中医药理论认为“五味中盐欲咸，下行入肾”，经盐炙后能使药性下行入肾。根据质谱检测结果，在清炒品中能检测到的5个成分，在盐制品中未能检测出，推测“加盐”在炮制过程中对成分结构组成变化影响更大。若要全面揭示其盐炙机理，上述数据还需结合药理药效进行进一步研究探索。