膝关节骨性关节炎患者滑膜和关节液中miR-29a和VEGF的表达水平及意义

崔黎明， 曹建刚， 李强， 张志强

1天津市宁河区医院骨一科(天津 301500)； 2天津市天津医院骨科(天津 300211)

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是临床常见的骨关节炎(osteoarthritis，OA)的一种慢性骨关节疾病，其发病率在中老年人中居高不下，严重威胁患者的生活质量，给患者家庭及社会带来极大经济负担[1]。临床常用影像学、关节镜方法检查KOA，但影像学不能灵敏地反映KOA患者关节受损程度，关节镜给KOA患者带来创伤，不利于常规检测患者病情[2]。因此，急需寻找可早期诊断、病情评估的指标。Ko等[3]发现微小RNA-29a(miR-29a)可通过靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)来抵抗KOA发病机制中的滑膜炎。VEGF在KOA患者滑膜和关节液中表达异常，且与KOA病情进程相关[2]。但miR-29a、VEGF在KOA滑膜及关节液中的关系尚未明确。因此，本研究通过探究分析miR-29a、VEGF在KOA患者滑膜、关节液中的表达情况及两者与病情进程的关系，以期为临床动态监测KOA发生与发展提供诊治靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年11月本院收治的KOA患者104例为研究对象，其中，男47例，女57例；年龄32～72岁，平均(57.93±6.59)岁；体质指数(body mass index，BMI)21.19～26.58 kg/m2，平均(24.58±2.31)kg/m2；并选取同期半月板损伤患者104例进行对照研究，其中，男50例，女54例；年龄30～74岁，平均(58.16±7.02)岁；BMI 为20.91～25.44 kg/m2，平均(23.29±2.26)kg/m2。两组性别、年龄、BMI差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

纳入标准：(1)所有KOA患者符合中华医学会风湿病分会确定的KOA判定标准[4]；(2)临床资料完整者；(3)年龄30～74岁；(4)符合Kellgren-Lawrence(K-L)分级标准Ⅱ～Ⅳ级者；(5)所有受试者签署知情同意书，该项研究经本院伦理委员会审核、批准。排除标准：(1)患有强直性脊柱炎、类风湿关节炎等风湿免疫性疾病者；(2)近期有注射关节药物史、服用止痛药史、服用糖皮质激素药物史者；(3)患有糖尿病、感染性疾病、血液病、慢性疾病、恶性肿瘤者；(4)合并严重心、肝、肾等器官功能不全者；(5)患有严重骨质疏松及其他类型的关节性疾病者。

K-L分级标准X线片显示：Ⅱ级患者关节间隙呈现可疑性变窄，出现明显骨赘；Ⅲ级患者关节间隙呈现明显狭窄，出现中等量骨赘及骨质硬化性该病；Ⅳ级患者关节间隙狭窄明显，出现大量骨赘，骨质硬化性病变严重，关节畸形明显。依据K-L分级标准将纳入KOA患者分组：Ⅱ级组31例，Ⅲ级组43例，Ⅳ级组30例。

1.2 主要试剂 TRIzol LS reagent购买于美国Life Technologies公司；Taq Man MicroRNA反转录试剂盒、Taq Man 通用PCR反应混合物及Taq Man Assaay均购买于美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 收集所有受试者关节镜检查时滑膜及关节液样本，用无菌注射器采集关节囊中关节液4 mL，置5 mL EP管中，以1 800 r/min离心12 min，取上清液保存于EP管中，于-80℃冰箱中冻存，待检。取受试者者关节滑膜组织置于标本袋中，保存于-80℃冰箱中，待检。

1.3.2 qRT-PCR法检测 -80℃冰箱中取出滑膜和关节液样本，冰上解冻，滑膜组织研碎，依照TRIzol LS试剂盒说明书加加TRIzol LS，提取总RNA，取2 μL总RNA利用紫外分光光度计检测RNA浓度及质量，合格样本进行下一步逆转录反应。按照Taq Man MicroRNA反转录试剂盒说明书将合格的RNA逆转录成cDNA。取1 μL cDNA，用Taq Man 通用PCR反应混合物及Taq Man Assaay将其PCR扩增、定量检测，引物序列见表1。反应体系总体积为20 μL：2×Taqman ®Universal master mix 10 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water 8 μL，F/R各0.5 μL。反应条件设置：97℃预热8 min；95℃变性20 s，64℃退火25 s，40个循环。miR-29a、VEGF分别以U6、β-actin为内参。2-ΔΔCT法对miR-29a、VEGF表达水平定量分析。

表1 miR-29a、VEGF及内参U6、GAPDH的引物序列

2 结果

2.1 两组滑膜、关节液中miR-29a、VEGF表达水平 与对照组相比，KOA组滑膜、关节液中miR-29a表达水平均明显降低(P<0.05)，VEGF mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)。见表2。

项目例数滑膜关节液miR-29aVEGFmiR-29aVEGF对照组1041.06±0.271.01±0.251.03±0.281.08±0.31KOA组1040.67±0.191.60±0.370.72±0.201.71±0.38t值11.56813.47410.2359.751P值0.0000.0000.0000.000

2.2 不同K-L分级KOA患者滑膜、关节液中miR-29a、VEGF表达水平比较 与Ⅱ级组患者相比，Ⅲ级组、Ⅳ级组患者滑膜中miR-29a表达水平明显降低(P<0.05)，且随分级增高降低越明显；与Ⅱ级组患者比较，Ⅲ级组、Ⅳ级组患者VEGF表达水平明显升高(P<0.05)。

与Ⅱ级组患者相比，Ⅲ级组、Ⅳ级组患者关节液中miR-29a表达水平明显降低(P<0.05)，且随分级增高降低越明显；与Ⅱ级组患者相比，Ⅲ级组、Ⅳ级组VEGF表达水平明显升高(P<0.05)，且随分级增高升高越明显。见表3。

项目例数滑膜关节液miR-29aVEGFmiR-29aVEGFⅡ级组310.76±0.221.45±0.350.85±0.261.41±0.33Ⅲ级组430.64±0.17*1.63±0.38*0.70±0.21*1.75±0.39*Ⅳ级组300.53±0.14*△1.72±0.40*0.59±0.18*△1.99±0.41*△F值12.6124.10110.92818.088P值0.0000.0190.0000.000

*与Ⅱ级组比较P<0.05；△与Ⅲ级组比较P<0.05

2.3 KOA患者滑膜和关节液中miR-29a表达水平与VEGF表达水平的关系 Pearson相关性分析显示，KOA患者滑膜、关节液中miR-29a表达水平与VEGF表达水平均呈负相关(r=-0.701、-0.686，P<0.05)。见图1、2。

2.4 滑膜和关节液miR-29a、VEGF mRNA及两者联合诊断KOA的价值 ROC曲线显示，滑膜中miR-29a对KOA诊断的ROC曲线下面积(AUC)为0.857(95%CI:0.804～0.911)，截断值为0.855，其敏感度、特异度分别为83.7%、71.8%；VEGF对KOA诊断的AUC为0.928(95%CI:0.894～0.962)，截断值为1.306，其敏感度、特异度分别为78.8%、93.3%；两者联合对KOA诊断的AUC为0.954(95%CI:0.928～0.981)，其敏感度、特异度分别为90.4%、90.4%。见图3。

关节液中miR-29a对KOA诊断的AUC为0.830(95%CI:0.774～0.886)，截断值为0.785，其敏感度、特异度分别为67.3%、84.6%；VEGF对KOA诊断的AUC为0.896(95%CI:0.869～0.950)，截断值为1.492，其敏感度、特异度分别为83.7%、87.5%；两者联合对KOA诊断的AUC为0.963(95%CI:0.941,0.986)，其敏感度、特异度分别为93.3%、88.5%。见图4。

图1 KOA患者滑膜中miR-29a与VEGF 表达水平的相关性

图2 KOA患者关节液中miR-29a与VEGF表达水平的相关性

图3 滑膜中miR-29a、VEGF联合诊断KOA的价值

图4 关节液中miR-29a、VEGF mRNA联合诊断KOA的价值

3 讨论

OA是在关节软骨病变、骨赘形成、滑膜炎的病变基础上发展的一种疾病，KOA是OA常见的一种骨关节疾病。KOA以关节疼痛伴关节活动受限、骨质增生、关节积液为主要临床表现，其发病率较高，发病机制尚不明确，难以治愈，严重影响患者生命质量，并给患者及其家庭带来极重心理负担和经济压力[5]。因此寻找能够早期诊断KOA的临床指标，及时正确评估病情，并给予合理治疗方案，这对提高患者生命质量具有重要意义。

miRNA是一类广泛存在于机体各处的具有高度保守性的非编码RNA，可通过与靶基因mRNA的3′端非编码区碱基互补，从而达到调控基因表达、蛋白翻译的目的，其在一系列生理病理进展中发挥极其重要作用[6]。大量研究发现，KOA患者滑膜、关节液中miRNA表达失调，如miR-19b-3p[7]、miR-140-3p[8]，miRNA具有作为KOA诊治的生物学指标的潜能。miR-29a是miR-29家族的一员，可在滑膜和关节液中稳定存在。Liu等[9]研究表明miR-29a可抑制类风湿关节炎发生发展；有关研究也已经证实miRNA-29a可抵抗膝关节骨性关节炎发病进程中的滑膜炎，在KOA发病进展中发挥抑制作用[5]。以上研究提示miR-29a在KOA患者体内低表达，抑制KOA发病进展。本研究中显示，KOA组患者滑膜、关节液中miR-29a表达水平均明显低于对照组，且KOA患者滑膜、关节液中miR-29a表达水平均随分级增高而降低，提示滑膜、关节液miR-29a参与KOA疾病的发生发展进程密切相关。

VEGF是典型的细胞因子，可在多种炎症活动中发挥作用，可调控内皮细胞自身增殖、迁移及血管新生等生物学过程，并影响滑膜血管翳的产生，其过表达可造成滑膜长期遭受炎症侵袭、软骨破坏等[2]。VEGF可参与类风湿关节炎[10]、强直性脊柱炎[11]、OA[12]等多种炎症活动。大量研究表明，VEGF与KOA患者功能影响、影像学分级及临床表现密切相关[13-15]，KOA患者关节液中VEGF呈高表达。以上研究表明，VEGF与KOA发病进程有关。本研究中，KOA患者滑膜、关节液中VEGF表达水平均明显高于对照者，且KOA患者滑膜、关节液中VEGF表达水平均随分级增高呈上升趋势，与祝百龙等[16]研究结果类似，提示滑膜、关节液VEGF参与KOA疾病的发生与发展，VEGF可作为KOA患者病情进展评估的临床指标。

有关研究表明，miR-29a与VEGF具有相关性[3]。本研究表明KOA患者滑膜、关节液中miR-29a与VEGF表达水平均呈负相关，提示两者可能通过相互作用，共同调控KOA发病进展。miR-29a、VEGF在KOA中表达失调，提示两者可能在KOA诊断中具有一定诊断价值。进一步研究发现滑膜、关节液中miR-29a、VEGF对KOA均有一定的预测价值，但特异度较低，两者联合诊断KOA滑膜、关节液中的AUC分别为0.954、0.963，敏感度分别为90.4%、93.3%，对应特异度分别为90.4%、88.5%。提示miR-29a、VEGF在滑膜和关节液中对KOA具有一定的诊断价值，两者联合可提高对KOA的诊断特异度，可较好地诊断KOA。

综上所述，KOA患者滑膜、关节液中miR-29a表达下调，VEGF表达上调，两者呈负相关，且对KOA诊断具有一定价值。但本研究样本量较少，可能存在一定偏颇，后期将扩大样本量深入研究。