脾气虚证与神经内分泌相关的生化指标的关联性研究概述

南梦蝶 程诺 贺倩 刘远欧 刘玥芸

脾气虚证是由于脾气虚弱，脾失健运而出现的以食少、腹胀、大便溏薄、神疲、肢体倦怠、舌淡脉弱等为常见症的证候[1]。脾气虚证常见于泄泻、胃脘痛、水肿、痰饮、痿证、小儿疳积，以及西医的慢性胃肠炎、慢性肾炎、慢性支气管炎、支气管哮喘等疾病，在不同疾病中有不同表现。近年来，大量研究表明脾气虚证会引起多系统多指标的改变，包括脑肠肽、神经-内分泌-免疫网络指标、能量代谢指标，以及酶学改变、肠道菌群紊乱等[2-4]。本文在通过中国知网(CNKI)检索对脾气虚证神经内分泌系统指标方面进行研究的实验类文献，比较与分析研究现况，并展望今后研究趋势。

1 脑肠肽在脾气虚证状态下有明显变化

胃肠激素是胃肠道(包括胰腺)中的内分泌细胞分泌的特殊化学物质，作为神经内分泌免疫网络中的一部分，与其他成分如细胞因子、化学递质等共同发挥作用，影响着胃肠道的运动，维持着机体正常的生理功能。胃肠激素中，既存在于胃肠道又存在于脑中，被称为脑肠肽，胃泌素(gastrin，GAS)、胃动素(motilin，MOT/MTL)、胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)、P物质(substance P,SP)、生长抑素(somatostatin,SS)、神经降压素等均属脑肠肽，脑肠肽在脑中由神经细胞合成，沿神经纤维传递到神经末梢释放，调节神经支配的细胞活动。对胃肠运动起促进作用的有GAS、MOT/MTL等，抑制胃肠运动的有生长抑素、血管活性肠肽、CCK。研究发现，脾失健运与脑肠肽分泌水平紊乱密切相关。探讨脾气虚证与脑肠肽的关系，对深入认识脾气虚证本质，寻找脾虚失健运的特异性、客观性的定量性指标具有重要的理论和实际意义。

现有脾气虚证研究涉及的脑肠肽有GAS、MOT/MTL、β-EP、SS、血浆降钙素基因相关肽(caleitonin gene related peptide,CGRP)、神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)、SP和生长素等。

1.1 GAS、MOT/MTL、生长素在脾气虚证状态下减少

魏彦明等[5]测得脾气虚模型家兔血清GAS显著降低。温庆祥等[6]、刘钺等[7]对脾气虚型功能性消化不良患者采用手法、隔药灸治疗后血清GAS明显高于治疗前，反向说明了脾气虚状态下GAS降低。多数动物模型研究[8-12]与此有类似结果。而研究结果与之相反的有：王小荣[13]、吕凌[14]得到脾气虚大鼠模型GAS反而显著升高。王洪海[15]研究结果表明GAS变化随时间波动：脾气虚证大鼠GAS第三周下降、第四周上升。吕琳等[16-17]、李楷[18]研究结果表明GAS变化因样本不同而不同：脾气虚证大鼠模型GAS在血清中含量降低，在下丘脑、胃、小肠中含量升高。

部分实验研究年代已较久[5-8,11-15]，所应用的检测手段如放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)及其精准度也与近来研究[16-18]所用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)、免疫组化法等存在一定差异，且GAS在体内各组织中有不同活性形式，检测时注意到不同亚类需要用到各自的抗体才能得到对于在脾气虚证状态下GAS含量变化趋势更具价值的结论。

多数研究表明，MOT在脾气虚证患者血清中出现下降趋势[6,7,19]，部分动物脾气虚证模型研究[8-9,11-12,20]结果与此相似。刘凯[21]研究还发现脾气虚证模型大鼠离体胃窦平滑肌对MTL引起的收缩反应敏感下降，下丘脑中MTL含量也有下降。王洪海[15]研究结果表明MTL变化随时间波动：脾气虚证大鼠MTL第三周下降、第四周上升。然而，也有研究表明MOT在脾气虚状态下出现上升趋势。陈锐[10]、赵锋[22]采用利血平注射液腹腔注射14天建立脾虚家兔模型，RIA法检测血清MOT，造模后与对照组相比，MOT明显上升，穴位埋线、捏脊治疗或四君子汤治疗后恢复到原来水平。

与GAS类似，MOT在调节胃肠道功能方面有正面的调节作用，较多研究[6-12,15]兼具两者变化含量的检测，故在研究检测手段上均存在不一致性的局限性。值得一提的是，个别研究[21]不仅报告了脾气虚状态下MOT的含量变化，还对于脾气虚状态下靶器官对其敏感程度的降低也进行了分析。

脾气虚证状态下，中枢神经系统通过脑肠神经影响脑肠肽的分泌合成[23-27]，一些研究表明脾气虚证动物模型的下丘脑和胃肠道组织中生长素含量下降[25-27]，其受体表达也有下调[26]。而杨可新[28]的研究提示脾气虚证大鼠模型的血浆生长素含量反而明显升高。

同上，个别研究[28]在造模方式上的明显不同可能对生长素含量带来不同影响，虽然同属脾气虚证动物模型，但也不除外疾病模型(慢性肾衰模型)因素对证型研究结果的干扰。

1.2 SS、CCK在脾气虚证状态下增加

张航向[19]RIA法检测脾气虚证患者血浆及胃窦SS含量明显高于胃热证、肝火上炎证患者。陈天娥等[29]用免疫组织化学染色检测到脾虚证胃溃疡模型的胃黏膜中SS阳性细胞分泌活性增强。多数动物模型研究[8,11-12,30]均表明脾气虚状态下，血或肠道组织中SS含量上升。吕琳等[16]研究表明SS的变化具有组织差异性，脾气虚模型组垂体、血、胃、肠组织中的SS含量明显高于对照组，而下丘脑低于对照组。陈旻丹[27]研究亦发现结肠平滑肌SS表达降低，而下丘脑神经细胞中SS表达无明显差异。然而，杨可新[28]研究结果提示脾气虚状态下SS含量可能出现下降。

大部分文献的方法学优势及局限性同前。张航向[19]将脾气虚证与其他证型患者对比而非与健康对照对比，难以明确SS的增加是否为脾气虚证状态下会出现的特异性改变。

多数研究表明脾气虚状态下，组织中CCK含量上升。脾气虚组患者血浆和胃窦CCK明显高于胃热组[19]，脾虚证模型大鼠下丘脑及结肠粘膜中CCK-8含量高于正常组[30]。与此类似，多数动物模型研究[23,26,31]表明在下丘脑、胃肠道、血清中CCK含量升高。而陈旻丹[27]研究表明CCK表达可能下降。但刘芳等[32]研究表明CCK随时间推移而先上升后下降。

关于CCK的研究结论相对较新，来源包括临床研究和实验研究，故可以推测脾气虚证状态下，CCK在一定时间内各组织中均表现下降趋势。

1.3 β-EP、VIP、SP在脾气虚证状态下变化不一

研究结果表明，β-EP变化因样本不同而不同：吕琳等[16-17]用耗气破气中药灌胃加饥饱失常法建立脾气虚证大鼠模型，模型组β-EP在下丘脑、垂体、血浆中含量降低，在胃、小肠中含量升高。多数动物模型研究[8,18,23]与此有类似结果。而在魏彦明等[24]对脾气虚雄性大鼠模型的研究中，血浆β-EP极显著升高，四君子汤治疗后恢复。

应指出的是，部分文献[16-17]均来源于同一研究团队时，研究结果一致性并不能完全代表可重复性。个别研究[24]有明显不同的研究结果，但不除外其应用的造模方式(利血平注射法)与其余研究均有较大差异(耗气中药灌胃法、饥饱失常法等)可能造成干扰。

陈天娥等[29]用免疫组织化学染色得到，脾气虚证胃溃疡动物模型的下丘脑、大脑皮层和海马等部位VIP阳性神经元分泌活性增强。陈倩[33]对脾气虚患者的得出的回顾性结论表明脾气虚状态下血VIP升高。部分脾气虚证动物模型研究表明[11-12,23,26]，下丘脑、胃肠道、血清中VIP含量升高。与此相反，刘凯[21]研究表明，脾气虚模型大鼠离体胃窦平滑肌对VIP的舒张作用反应敏感性下降，且平滑肌中VIP含量明显降低。部分研究[27,31]得到与此类似的结论。

通过总结以上研究，难以得出与其他抑制性脑肠肽类似的结论，即VIP在脾气虚状态下呈增高趋势。通常认为，回顾性研究所提供结论的可信度一般。其余实验类文献的造模方法类似，检测手段明确，取材组织类似，而结论不一，可见VIP在脾气虚证状态下会出现一定变化，但其表达及作用效应是否会与其他调节因子发生相互作用尚待进一步明确。

不同研究表明，脾气虚证状态下SP含量可有不同的变化。陈倩[33]对脾气虚型肠易激综合征患者采用隔药灸法，治疗后血清SP均明显下降。陈天娥等[29]研究提示亦其含量增加(脾气虚证胃溃疡模型中SP阳性细胞分泌活性增强)。而陈旻丹[27]研究提示其在不同组织内的变化趋势不同，功能性腹泻脾气虚证大鼠模型结肠平滑肌细胞SP表达显著减少，下丘脑神经细胞SP表达显著增加。而其他研究如冯晓帆等[34](下丘脑和海马)、李楷[18](海马及小肠组织)均检测到SP显著减少。

大部分文献的方法学优势及局限性同前。脾气虚证状态下SP含量在各组织中的变化以及与其他调节因素的相互作用尚待进一步明确。

1.4 CGRP、NPY、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、促胰液素(secretin, Sec)、亮氨酸-脑啡肽(leucine-encephalin, L-EK)在脾气虚证状态下的变化有待研究

魏彦明等[24]用RIA法检测到脾气虚大鼠的CGRP升高、NPY降低。龙奕文[25]的研究也发现脾气虚证模型大鼠的血NPY的含量下降。陈旻丹[27]检测功能性腹泻脾虚证大鼠结肠平滑肌和下丘脑神经细胞中CGRP含量及表达mRNA的含量，分析得到CGRP的表达在结肠平滑肌细胞中降低，在下丘脑神经细胞中升高。陈倩[33]在脾气虚型肠易激综合征患者采用隔药灸法治疗后，检测到血清5-HT明显下降。李楷[18]用ELISA法检测到脾气虚大鼠模型海马及小肠Sec含量显著降低。李刚[35]用RIA法检测脾气虚证大鼠模型L-EK含量，血清L-EK显著降低，额叶皮质、下丘脑、垂体L-EK水平显著升高。

总结以上对脾气虚证状态下脑肠肽的研究可以发现，不同研究中脑肠肽受到脾气虚证影响而发生的变化并不一致，甚至相互矛盾，难以仅通过文献学习而确定脾气虚证特异性的脑肠肽改变。究其原因可能：一是脾气虚证状态下，为纠正胃肠道功能状态，各种脑肠肽均有波动，组织性质(神经系统组织、胃肠组织、血液样本)不同、时相(脾气虚证出现时间、生物钟)不同、脑肠肽之间协同拮抗关系复杂，但却少有研究相互比较各种胃肠道对肠胃功能调节的作用差异；二是从检测手段方面考虑，仅一类脑肠肽下就有多种分子形式，不同分子形式如果仅用一种抗体来检测，不论用RIA、免疫组化还是ELISA等检测方法，其结果不够严密。

2 神经调节相关指标在脾气虚证状态下有不同程度改变

神经调节是在神经系统的直接参与下所实现的生理功能调节过程，是人体最重要的调节方式。脾气虚证以食少、腹胀、大便溏薄、神疲、肢体倦怠为主要特点，尤其以胃肠道表现为突出，胃肠道由中枢神经系统、肠神经系统和自主神经系统共同支配，神经系统调节紊乱，因而在一系列指标上出现相应改变，如神经细胞成分、神经递质等。

2.1 自主神经系统功能在脾气虚证状态下出现明显紊乱

探究脾气虚证在自主神经系统方面影响的研究常以乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)或胆碱酶(acetylcholinesterase,AchE)、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)等为研究内容。魏彦明等[5]用间苯三酚显色法测得脾气虚证家兔血清AchE升高。祝淑贞[36]检测脾气虚证患者的血清AchE活性低于正常水平。脾气虚证动物模型血浆cAMP含量升高、血浆cGMP无明显变化、cAMP/cGMP比值升高[37-38]。张广霞[8]测得脾气虚模型组血清Ach降低、cAMP降低、cGMP升高、AchE升高，ELISA法测得骨骼肌乙酰胆碱受体M2受体降低。神经递质(如Ach)可以通过激活G蛋白、激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)、催化ATP转化成cAMP，cAMP进一步激活蛋白激酶(proteinkinase A, PKA)，引起级联反应或阳离子通道的开放。

脾气虚状态引起Ach降低、cAMP/cGMP比值升高，这表明脾气虚模型植物性神经功能的异常，即交感神经功能低下和副交感神经功能偏亢，故产生涎多、腹痛、便溏等表现。但是cAMP/cGMP比值升高在脾气虚证动物模型研究中并不统一。自主神经功能紊乱可影响胃肠平滑肌[5]、骨骼肌功能、体温调节[8]，可使机体表现出肠鸣腹泻、乏力倦怠等脾气虚证常有表现，目前还未见对于脾气虚证状态如何影响自主神经功能紊乱进而引起Ach、cAMP、cGMP水平变化的深入研究。

2.2 中枢神经系统功能在脾气虚证状态下出现不同程度紊乱

脾气虚证对中枢神经系统的边缘系统如海马、侧脑室以及下丘脑有一定影响，现仅有关于蛋白激酶C(proteinkinase,PKC)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)、高香草酸(homovanillic acid,HVA)、3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxy-phenyl aceticacid,3,4-DOPAC)、多巴胺(dopamine, DA)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)cAMP效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)等的研究。王淑娟[39]采用改良Takai法检测到脾气虚大鼠模型海马组织的膜PKC活性升高、胞浆PKC活性明显降低，衰老大鼠更明显。王洪海[15]发现脾气虚证模型组大鼠海马的各项单胺类神经递质如5-HT、NE、5-HIAA和HVA建模3周时明显降低，3,4-DOPAC逐渐下降，而DA水平明显升高，且与大鼠嗜睡、倦怠、少动的行为表现相关。卓缘圆[40]观察到脾气虚证大鼠侧脑室下区、海马齿状回区被溴脱氧尿苷标记的神经干细胞受损，检测到两个脑区bFGF的表达增加。李楷[18]测得脾气虚大鼠的海马及小肠组织cAMP/PKA-CREB信号通路中cAMP、PKA的CREB的相对表达量降低。脾气虚大鼠下丘脑葡萄糖转运体1、葡萄糖转运体3表达水平下降，与下丘脑、胃、空肠中的β-EP、CCK、VIP表达水平异常有相关性[23]。

多数文章来源于新近研究，且利用免疫组化标记的切片观察或组织匀浆研究相关指标改变，检测方法明确，造模手段成熟。但每项指标的同类研究较少，个别研究[15,18,23]同时对脾气虚证状态下脑肠肽的变化进行研究，并认为各信号通路的改变与脑肠肽变化存在相关性，但其变量过多，故结论的参考价值有待商榷。

2.3 肠神经系统功能在脾气虚证状态下明显受损

刘凯[21]、丁伯龙[41]使用免疫组化法检测到脾气虚证模型大鼠胃肠各部位的神经型一氧化氮合酶增加，提示一氧化氮(nitric oxide, NO)的抑制作用增强。消化道的Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是肠道慢波的起搏细胞，与肠神经系统末梢和平滑肌细胞构成胃肠运动的基本功能单位。丁伯龙[41]观察到脾气虚大鼠模型幽门、降结肠组织中神经纤维数量明显降低，肠神经-ICC之间信号通路损伤，Ach、SP、VIP、NO、蛋白基因产物9.5和神经纤维数量明显降低，提示肠肽分泌及肠神经功能均降低。赵璠[42]通过动物实验发现脾气虚大鼠小肠组织M2受体表达增多、控制平滑肌收缩的M3受体表达下降，抑制M2受体介导的阳离子内流，使小肠平滑肌收缩幅度变小，从而引起小肠运动减慢。宋囡等[43]测得脾气虚证大鼠胃组织cAMP-PKA-CREB途径整体均有下调。而中药健胃合剂[44]能通过增加乙酰胆碱转运蛋白、乙酰胆碱受体M1加快胃肠运动。

3 下丘脑-腺垂体系统在脾气虚证状态下出现功能紊乱

下丘脑-腺垂体系统通过神经-体液性联系，即下丘脑促垂体区的肽能神经元通过所分泌的肽类神经激素(释放激素和释放抑制激素)，经垂体门脉系统转运到腺垂体，调节相应的腺垂体激素的分泌，进而影响靶器官(性腺、肾上腺、甲状腺)的功能。

脾气虚状态下，下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱，现有研究对血清孕激素(progesterone，P)、雌二醇(estradiol，E2)、睾酮(testosterone，T)含量变化的研究结果不一致。黄雪琪[45]脾不统血证雌性大鼠模型E2下降，P升高。李志强等[46]的脾气虚雄性大鼠血清E2上升、T下降。王立峰[37](脾气虚雄性大鼠)、马媛媛[38]检测到血清E2、T均升高。王昕等[47]检测到脾气虚雄性大鼠血清E2、T下降。由此可以认为脾气虚证会导致丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱，但是考虑到性激素的周期性变化，无法确定性激素调节紊乱与脾气虚证单一因素有关。

现有的脾气虚证动物模型研究[15,37,48]的结果表明，促肾上腺皮质激素释放激素、促肾上腺皮质激素和皮质醇浓度均有不同程度降低，下丘脑-垂体-肾上腺轴功能减弱。

下丘脑-垂体-甲状腺轴相关方面研究较早就集中出现。大量重复类型的实验研究促甲状腺素释放激素(thyrotropin releasing hormone, TRH)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)、三碘甲腺原氨酸、四碘甲腺原氨酸等指标的结果提示，脾虚状态下甲状腺功能降低[8,15,37-38,46, 49-50]。而甲状腺功能低下又会进一步导致胸腺[51]、淋巴细胞等免疫器官和细胞的变化。脾气虚证动物模型研究[35]提示L-EK可在中枢神经系统胺类递质介导下，减少TRH、TSH释放。

4 水盐代谢相关激素及受体在脾气虚证状态下表达改变

脾主运化水湿，对其现代生物基础的研究则着眼于抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)和醛固酮(aldosterone，ALD)及其作用靶点，如水通道蛋白(aquaporin, AQP)等。张广霞[8]RIA法检测到脾气虚大鼠模型血清ADH、ALD升高，ELISA法测定小肠及降结肠的AQP3降低、肾脏的AQP2含量升高。崔永霞[20]用免疫组化法测定回肠中AQP4，脾气虚证大鼠模型回肠AQP4表达明显减少，十二指肠中胃蛋白酶明显减少。AQP4在结肠表达最丰富，小鼠剔除相关基因后，结肠水通透性下降，粪便含水量增加[52]。水盐代谢和水转运方面的调节异常，在水液调节方面为脾主运化水液的中医理论提供指标依据。肠段AQP3低表达可引起结肠粘膜对水重吸收减少导致腹泻便溏，符合脾虚不运，水湿内停的中医证候病机。

5 其他指标在脾气虚证状态下的改变有待研究

段永强[11]检测脾气虚证大鼠血清胰岛素、空腹血糖水平明显下降。姜晓琳[53]用ELISA法测得脾气虚大鼠模型血清及心肌中脑钠肽和cAMP含量均明显升高，用PCR检测到心肌细胞bFGF和PKA的表达水平明显升高。有关胰岛和心肌细胞在脾气虚证状态下的分泌功能的临床研究较为孤立，尚不足以确定有价值的结论。各项研究对于指标变化与脾气虚证表观症状和体征的关联性的分析水平仍停留在推测其作用机制(如抓握力减退与骨骼肌Ach受体数量[8]，单胺类递质和倦怠少动[15]，NO含量，Ach及受体与便溏[21]等)，缺乏统计学上确凿的证据。

6 总结与展望

探究脾气虚证对神经-内分泌系统影响的实验研究中，涉及脑肠肽的指标占多数，其余指标占比重较大的为中枢神经系统指标、下丘脑-垂体-腺体(性腺、甲状腺、肾上腺)轴指标和植物神经功能指标。部分实验将以上指标进行综合研究后认为，脾气虚证状态下神经系统的递质[21]、受体及细胞通路[18,23,41]与脑肠肽或与其他激素[20,35]均有相互作用。此外，脾气虚动物模型各组织中酶学改变[11]、肌肉能量代谢相关信号通路[26]均与脑肠肽水平变化有关。可见，脾气虚证状态下，脑肠肽在各组织中的表达水平受到多方面因素影响而出现不同程度的改变，而且这种改变与其他神经内分泌调节的指标的变化具有相互作用，这其中的某些改变可以解释部分脾气虚证常见的体征和症状表现。动物实验研究大部分造模方式大同小异，但部分研究模糊了脾气虚证、脾阳虚证甚至是脾肾两虚证的区别，还有一些研究的造模方法的合理性有待考量，推测这些研究与大多数研究得出不同结论[10,22]的原因之一就在于造模方法的差异性。对照的设置上，大部分研究设置了空白对照组、各类治疗手段(健脾补气药物、灸法、电针、埋线、捏脊)组和(或)自然恢复组进行对比相关指标。大部分治疗组均在某些指标上相对于脾气虚证模型组有恢复正常指标的趋势，可以定性推测指标变化与脾气虚证有一定的相关性，但由于干预措施的形式多样，难以实现定量分析各指标的特异性或敏感性。早期文献未关注到脾气虚证模型各指标的水平变化具有时效性，后期的研究中还因此设置不同时间段检测模型组别，部分指标在造模后一定时间内经历先异常后正常的变化趋势，但指标恢复正常趋势开始的时间并不一致，难以确定先异常后正常的机制是否与代偿性或适应性变化或其他未知因素相关。早期研究多单纯对血样或组织切片中有限个数的各物质指标含量变化进行报道，现阶段已有着眼于细胞信号通路、基因表达调节通路在脾气虚证状态下所发生改变而进行的探索性研究。临床研究数量较少，大部分临床研究的方法学质量较低，均为小样本量单中心研究，从对照组设置方面，仅有个别研究与健康受试者进行对比，或仅对脾气虚证状态下的指标改变做回顾性分析，涉及的指标集中而且亦较少，采集的数据有限，未与其他神经内分泌系统指标进行多因素分析，临床研究的设计方面亟待更健全的方案以揭示脾气虚证的生物学基础。此外，尽管存在少数实验类研究会以不同方剂对于不同指标及相关体征的影响为侧重，但是大多数揭示针对脾气虚证的症状和体征，如腹胀、便溏、神疲、乏力，还需要更多的研究探索出症状特异性的指标及其变化方向。

以脑肠肽为主，神经内分泌调节相关的指标在脾气虚证状态下存在表达水平的改变，这种改变受到多重因素的影响，而且这种影响相互交叉、相互渗透形成复杂的神经内分泌调节网络系统，有待于学者们的进一步深入严谨研究才能揭示。传承数千年的中医辨证论治思维体系具有多层次多途径的特征，神经内分泌调节网络的复杂机制与中医的整体观存在一致性，因此在调控神经内分泌的指标表达水平的过程中发挥中医药优势、阐明中药治疗脾气虚证的作用靶点和相关机制是值得关注的方向。以上内容是基于神经内分泌调节相关指标探讨中医药治疗脾气虚证的实验研究和临床研究综述，相信随着学者们对脾气虚证状态下神经内分泌调节网络认识的不断深入，将会涌现出更多的精确至生物分子网络层次的研究，为阐明脾气虚证的生物学本质作出有益尝试。