肝郁脾虚型溃疡性结肠炎大鼠实验模型研究进展

柳荣，申睿，朱向东，高艳奎，王欢，钟兴腾

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以大肠(结肠与直肠)黏膜与黏膜下炎症为主要特征的慢性非特异性炎症性疾病，其病因病机尚不明确。目前本病病因、病机尚不够明确，其病程漫长，常反复发作，为现代难治病之一。临床研究表明[1]，心理社会因素的应激可引起胃肠道功能紊乱，约有74%UC患者认为，社会心理因素对UC有很大影响[2]。也有学者认为[3]情志因素为炎症性肠病复发的独立危险因素。而与之密切相关的肝郁脾虚证是UC的主要证型之一。中医药治疗UC具有广阔的前景，借助于动物模型的间接研究，可以排除很多干扰因素，并且更有效地认识UC的发生发展规律，同时也避免了人体实验造成的伤害，但目前肝郁脾虚型UC动物模型的建立尚无统一的标准。因此，选择建立正确合理的动物模型，探讨其病因病机以及中医药应用等具有重要意义。目前肝郁脾虚型UC动物模型的建立方法有单纯理化因素造模，单纯中医理论造模和病证结合造模，现将近年来关于肝郁脾虚型UC大鼠模型的研究进展综述如下。

1 单纯化学药物模型—CCl4注射法

二十世纪70年代末期湖南医科大第一附院的陈国桢等[4]最早用CCl4建立了小鼠慢性中毒的肝郁脾虚证模型。CCl4为有毒物质，可损伤肝、脾、肾、胰、肠等多脏器。据研究表明[4]，当慢性CCl4中毒时，肠黏膜表层出现溃破，固有膜内有明显水肿及炎细胞浸润，微绒毛因水肿而肥大变短，故此法理论上适用于建造肝郁脾虚型UC模型。造模方法为：取雄性大鼠，皮下注射10%CCl4花生油溶液，5 mL/kg，每周2次，共4周，首次剂量加倍。

CCl4注射法造模仅使用理化刺激建立模型，仅片面的造成大鼠大肠、肝脏、脾脏等的损伤，片面的将肝脏、脾脏损伤视为肝郁脾虚是十分荒谬的，其忽视了中医整体观念，错误的将中医肝脾与西医肝脏、脾脏混为一谈，故其模拟出的动物模型很难真实地反应中医证候特点。此外，此模型制作2年后，实验大鼠肝脏仍有结节、假小叶存在，对UC模型来说干扰因素极大。此法近年来已经很少有人使用。

2 束缚式模型

UC的病因至今仍不明确，其心理因素在疾病产生、恶化中具有重要地位。束缚式动物模型为肝郁脾虚型动物模型中最为常见的造模方式，将动物进行捆绑，从而使其肝气郁滞，情志不畅，进而引起精神抑郁；气郁化火，肝失柔顺之性，则急躁易怒；肝气横逆犯脾，脾气虚弱，不能运化水谷，则食少腹胀；气滞湿阻，则肠鸣矢气，便溏不爽，或溏结不调；肝气犯脾，气机郁结，运化失常，故腹痛则泻。

2.1 单纯束缚模型

单纯束缚模型现有四肢捆绑束缚[5]、模具束缚等[6-7]方法，束缚时间为7～21 d[5-7]，以21 d最为常见，每日束缚时间为3～8 h不等，以8 h为最常见。此种模型采用束缚激怒大鼠使大鼠肝脾功能失调、脾虚肝郁，此方法符合中医整体观念，但此种造模方式的稳定性、可靠性和可重复性差。经过束缚引起致病的强度、病程持续时间以及大鼠的个体耐受度差异使此模型难以进行统一化处理，并且大鼠模型的自然恢复速度极快，造模不可控因素较多，难度大。且此方法主要针对制造肝郁脾虚证型模型，其对是否成功制造UC模型无可靠性依据和稳定性。

2.2 限制活动+限制饮食+三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠模型

TNBS是一种半抗原物质，与大分子组织蛋白结合后成为一种抗原物质，引起体内免疫机能反应进而诱发肠道炎症。乙醇可刺激并损伤结肠黏膜，使黏膜屏障遭到破坏。造模方法：大鼠禁食后麻醉，从肛门插入导管深6～8 cm后，注入100 mg/kgTNBS+ 50%的乙醇0.25 mL的混合溶液，倒置30 s。此法可造成1～2周左右的炎症[8]。此种造模方式目前可见两种，一种于限制饮食限制活动整体结束后进行TNBS/乙醇混合液灌肠造模，邱家权[9]、程小丽[10]、曹燕飞[11]等采用此方法造模，此方法限制饮食限制活动时间为2～3 w[9-11]，以3 w为常见。另一种为先限制饮食限制活动，1 w后进行TNBS/乙醇混合液灌肠造模，然后再进行2 w限制饮食限制活动造模。谷松[12]、毛颖[13]、秦震声[14]、王轶[15]等均采用此种方法造模，造模过程中大鼠逐渐出现胡须下垂、扎堆、懒动、饮食减少、细声尖叫、毛少光泽等肝郁脾虚证症状。

此种模型为病证结合动物模型，其具有中医病因病理理论依据，且在其模型建立后可通过动物体表特征、活动、大小便形态等评价模型，判断其是否符合中医证候特点，弥补了中医传统病因致病的模糊性，加强了模型的可重复性和模型建立的可靠性。该模型的建立操作简单，可重复性高，且对动物性的伤害性较低，成功率高，是目前最常用的UC动物模型之一，适合UC免疫学角度的研究[16]。

2.3 限制活动+限制饮食+乙酸灌肠模型

上世纪70年代开始有学者运用乙酸建立大鼠 UC 模型。乙酸呈弱酸性，能增加血管通透性、促进纤维蛋白水解、干扰凝血、损伤肠道黏膜，引起炎症反应[17]。具体方法[18]：大鼠禁食后麻醉，倒立后从肛门插入导管注入4%～5%乙酸溶液15～30 s后，注入0.9%氯化钠溶液冲洗3次。并配合束缚刺激每天约8 h，连续3 w合并饮食失节法复制中医证与西医病相结合的肝郁脾虚型UC大鼠模型[19-23]。实验后动物出现粪便溏泻、肾上腺重量增加、胸腺重量下降、便血、喜扎堆、体重减轻、食欲下降等症状。乙酸模型操作简单，可重复率高，短期内可出现明显症状，适用于急性炎症、炎症介质、致炎机理及中药抗炎机理的研究，此方法在实验性UC模型的建立中应用非常广泛。但由于此模型致病因素单纯，乙酸刺激大肠仅可导致肠道表面损伤，与临床致病因素有较大差异，且此种损伤容易自愈，并不适用于观察病程长的实验。

2.4 限制活动+限制饮食+免疫致敏+局部乙酸刺激模型

此模型的原理主要是在结肠局部发生阿瑟氏(Arthus)反应[24]，为实验性局部过敏反应，可使局部出现水肿、出血和坏死等剧烈的炎症反应。造模方法[20,23,25-28]：取大鼠的结肠黏膜组织加福氏佐剂制成免疫制剂。于第1、7、14、21天分别于足跖内注射抗原4 mg(末次注射不加佐剂)。并于第1、7、14、21天用20%乌拉坦4 mL/kg麻醉大鼠后，用导管插入大鼠肛门注入5%醋酸1 mL，用乙酸诱导结肠溃疡。同时对大鼠进行限制活动及限制饮食，每天约8 h，连续3 w，造成肝郁脾虚型UC大鼠模型。本法重复性好，是外源物质引起宿主反应、基因和免疫影响三者相互作用的结果，可以较好地模拟人类UC病变的慢性活动性特点，并可产生与人类UC较为接近的临床症状及肠道病变，且此种造模方法不易自愈，可以进行周期较长的实验。但此方法需要一定的设备、条件及掌握熟练的技术[16]。

3 夹尾法急性激怒模型

夹尾法其原理与束缚法一致，通过止血钳夹尾激怒大鼠从而使其急躁易怒，肝气横逆犯脾，气机郁结，运化失常，腹痛而泄泻。

3.1 夹尾法急性激怒+限制饮食模型

欧阳河泉[29]认为心理、精神的不良应激和不良饮食习惯是影响胃肠道功能异常的主要病因。造模方法:每日用长海绵镊子隔双层纱布钳夹鼠尾末端1/3处[30]或用塑料夹夹住鼠尾[31]，使其暴怒挣扎，并与其他大鼠持续厮打30 min，每日1～2次[30-32]；同时给予隔日进食，模拟饥饱失常。连续2 w后出现毛发枯黄变暗、饮食量减少、体质量减轻、大便稀溏、伴易怒或抑郁状态，提示造模成功。止血钳夹尾激怒法相对较为符合肝郁脾虚证的中医病因病机，但其反映的只是在应激状态下的病理，其引发的大鼠受到刺激后的时间及程度都不能进行系统量化，是否达到“怒伤肝”的程度也无法确定，且此种病理状态自然恢复快，故此方法所造动物模型的稳定性、可靠性和可重复性差。

3.2 夹尾法急性激怒+限制饮食+限制活动+TNBS/乙醇溶液灌肠模型

胡政[33]采用TNBS/乙醇溶液灌肠+限制饮食+限制活动+夹尾法急性激怒法制作肝郁脾虚型UC大鼠模型。具体方法：将大鼠进行四肢束缚，同时限制饮食，每天9 h，配合间断性夹尾刺激，每次10 min，每天4次。2周后，进行TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 mL)灌肠。造模后大鼠皮毛稀疏无光泽、喜扎堆贴边、反应迟缓、大鼠饮食量减少、体重减轻、易激怒等现象。此造模方法较前法具体全面，但操作较为复杂，制作模型时动物差异性较大，稳定性、可靠性和可重复性差。

4 游泳疲劳+限制饮食+限制活动模型

此方法根据中医病因发病学原理，采用慢性束缚应激法建立肝郁证模型并采用过度劳累加饥饱失常法建立脾虚证模型，复制中医肝郁脾虚证大鼠模型[34]。此造模方法目前有两种方式，第一种[34-35]为：每日将大鼠置于盛有温水(22±1)℃的大塑料桶中游泳10～20 min，限制自由活动3 h，在此基础上可增加夹尾30 min、摇晃5 min[35]。配合隔日喂食，连续3 w。第二种[36]为：山西白醋灌胃20 mL/kg，然后把大鼠放入特制铁筒中限制活动，使大鼠在水中站立，剑突以下浸人水中4 h，水温控制在(20±2)℃，1次/d，连续造模10 d。此方法，第一种较为常见，但其游泳疲劳时间较短，并且为单纯中医病因复合因素模拟建模，造模具有半真实性和抽象性。第二种为中西医病证结合动物模型，且浸泡站立疲劳时间较久，但此方式操作具有设备条件限制性，且白醋灌胃对胃肠的刺激受动物自我恢复性影响，适用于短期实验，不适用于长期药理疗效观察。

5 苦寒泻下法

中医认为，过用苦寒，久之损伤脾阳。研究发现[37]，脾虚证与胃肠道功能、胃肠道激素、胃肠道形态结构改变，免疫学改变，神经、内分泌、微量元素改变等均有联系。长期服用大黄、番泻叶等苦寒药物亦可导致免疫指标的下降[38]。

5.1 苦寒泻下+限制饮食+限制活动模型

本法苦寒泻下，损伤脾阳，配合束缚激怒大鼠，以及饥饱失常多因素造模，属复合因素模拟中医传统病因建立动物模型。造模方法[39-41]：将大鼠实验前10～12 h禁食不禁水，分别予以0.4 g/mL番泻叶煎剂灌胃，给药体积10 mL/kg，每日1次，合并束缚其上肢及肩背胸腹部，限制大鼠搔抓头面部，但不限制其活动，束缚时间为1 h，连续3 w。此法符合中医病因病理，但UC的最典型临床表现为排出带有血、脓和黏液的粪便，此方法造模后出现稀便，但极少伴有血、脓。

5.2 苦寒泻下+夹尾急性激怒法模型

此法采用夹尾刺激急性激怒大鼠，“怒伤肝，久则郁”，使之肝气横逆犯脾，气机失常而致泄泻。具体方法[42]：用止血钳夹住大鼠的尾巴，每次刺激30 min，3次/日，令大鼠相互撕咬、打斗，3 d后开始用大黄灌胃1.5 mL/2次，夹尾改为2次/d，15 min/次，夹尾与灌胃同时进行共10 d，期间配合隔日进食。造模后，大鼠出现饮食减少、体质量减轻、扎堆、倦卧、毛发枯乱、淡漠、易暴躁、肛门污秽等肝郁脾虚症状。此法使用苦寒泻下药物通常为大黄、番泻叶，有研究显示[38]，番泻叶泻下效果比大黄强，且大黄在产生泻下作用后又可出现便秘。大黄、番泻叶均可使免疫指标下降，但大黄内还含有增强免疫力等的有效成份，能与令机体暂时出现免疫力下降的有效成份相对峙，而番泻叶纯泻无补，可以作为苦寒泻下药物的首选。

6 电击法+限制饮食+乙酸灌肠模型

电击可对动物造成强烈刺激，使其郁怒伤肝，长期饮食失节可致动物脾虚，再结合乙酸灌肠可复制中医“证”与西医“病”相结合的大鼠肝郁脾虚型UC模型。张芳艳等[43]将大鼠放入电击笼中，电压为20～30 V，每日电击2次，每次20 min，配合饮食失节，连续3 w，然后用乙酸灌肠诱导结肠溃疡，制备大鼠肝郁脾虚型UC模型。此法对设备等条件要求很高，使用者较少，且电击对动物刺激过于强烈，无法把握仅激怒大鼠，长期不定时刺激可能会造成动物恐惧，“恐伤肾”，可影响导致其他证候产生。

7 子母分离应激+限制活动+限制饮食模型

研究表明[44]哺乳期母子分离会导致小鼠脑组织抗氧化酶基因、脑源性神经营养因子基因、糖皮质激素受体基因表达量下调以及蛋白氧化损伤，进而影响脑组织正常功能。使小鼠成年后抗抑郁能力降低，当受到外界慢性应激刺激处理时，容易产生抑郁样行为。此法运用精神-神经-外周刺激三种因素复合造模法构建肝郁脾虚证大鼠模型。具体造模方法[45-46]：实验用幼年SD大鼠从出生第2天起开始造模，适应性饲养1 w，将乳鼠取出单独小笼饲养两周，每天2～3 h，配合直肠灌注0.5%的醋酸每次0.4 mL/d。然后束缚大鼠上肢及肩胸部，束缚时间为2～3 h/d，束缚2 w，不限活动，期间进行单独分离饲养。模型建立后依靠动物表征评价、动物证候评价等评价方法评价模型，判断模型建立是否成功。

8 孤养+限制活动+限制饮食模型

研究表明[47]，孤养可导致大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进、中枢5-HT功能低下，出现抑郁和焦虑样行为。郭建丽等[48]采用孤养配合限制饮食、限制活动的方法，将大鼠放入自制笼中，限制其自由活动，每笼1只孤养，每天束缚6 h。每周给大鼠不定时的禁食2次，造模时间3 w。造模后通过实验性肝郁脾虚症状、体征和相关指标测试，判断造模是否成功。

子母分离和孤养这两种造模方法，都有其独特的理论依据，但这两种方法其概念自身具有模糊性，造模时施加病因的可控性差，且受个体差异性影响较大。

9 小结

近年来制备中医动物模型的方法越来越多，为开展研究提供了很多途径。但中医动物模型的制备成功与否一直备受争议，还存在不少问题。以上造模方法大致可分为三类，单纯理化因素造模方法，单纯中医理论造模方法和病证结合造模方法。首先，单纯理化因素造模方法仅使用理化因素刺激，造成动物肝脏、脾脏、大肠的损伤，将中医肝脾与西医肝脾混为一谈，并完全忽视了造成中医病证的病因病机，此种造模方法不符合中医整体观念。其次，单纯中医理论施加因素造模方法有其独特的优点但也存在不容忽视的缺陷，中医是以人为整体，肝郁脾虚证型的制备均与刺激情志相关，但人和动物的情感并不能达到完全同一性，故其具有半真实性和抽象性，且中医动物模型的稳定性、可靠性和可重复性较差。最后，病证结合造模方法既符合中医病因病理，又符合西医疾病模型的建立，具有单纯理化因素模型和单纯中医理论模型所不具有的优点，但应该注意的是，目前认为UC的发病是外源物质引起宿主反应、基因和免疫影响三者相互作用的结果，其病程漫长，常反复发作，而TNBS/乙醇溶液灌肠模型和乙酸灌肠等模型仅利用理化因素直接刺激，造成肠黏膜及血管损伤，其病程维持时间短，且与临床病因病机及疾病过程差异较大。因此，探讨UC发病的病因病机，建立系统合理的中医评价体系，寻找特异性指标已刻不容缓。

综上所述，束缚法对大鼠情志的影响已有较多人研究证实，其配合饮食失节刺激，所制成的肝郁脾虚证型模型相较于其他方法有更多的理论和实验依据。免疫复合法模型体现了肠道黏膜损害与免疫失调这两个与人UC相似度极高的病理特征，造模后病程持续时间较长。笔者认为，束缚法结合饮食失节法结合免疫复合法是现阶段一种较为符合肝郁脾虚型UC病理特征的造模方法。随着科技的进步和对中医病因病机学更深入的探索，对UC基因、免疫等更深入的研究将为建立理想的UC模型奠定基础，为解决UC这一世界难治病提供更好的条件。