脓毒症体内外模型研究进展

李 晗， 田李均， 韩旭东

脓毒症（sepsis）被定义为机体对感染反应失调所致的危及生命的器官功能障碍[1]，是危重症患者死亡的主要原因。近年来，脓毒症的患病率和脓毒症相关死亡人数一直在增加[2]。Fleischmann等[3]研究指出，脓毒症的总体院内病死率约为25%～30%，当存在休克时，则高达40%～50%[4-5]，迄今为止还没有有效的特异性抗脓毒症治疗措施，脓毒症及其相关并发症仍是当代医学的一大挑战，也是全世界重症监护病房长期存在的问题。然而脓毒症潜在的病理生理学机制至今仍知之甚少。为了研究脓毒症复杂的分子学机制、深入了解脓毒症期间机体损伤后发生的病理生理变化，进而发现潜在的治疗药物，各种实验模型相继出现。本文将对脓毒症体内外实验模型分别进行阐述，为适宜而准确地应用实验模型去研究脓毒症的病理生理学机制和测试潜在的新型治疗药物提供理论依据。

1 脓毒症体内模型

1.1 血流感染模型

病原微生物和毒素进入血液循环，对机体的器官功能造成损害，严重者可出现休克、多脏器功能衰竭、弥散性血管内凝血甚至死亡[6]。因此血流感染模型主要是模仿病原微生物和毒素侵入血流所引起的全身性感染。目前常用的主要有内毒素模型和细菌感染模型。

1.2 内毒素模型

体内内毒素模型已被广泛用于研究脓毒症的病理生理学机制[7]。内毒素是革兰阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）成分，脓毒症患者血液中内毒素的浓度与病情和预后密切相关。给动物静脉注射内毒素可以诱导多种炎性介质的合成和释放，引起急性感染症状，死亡率较高。内毒素可以经静脉注射、腹腔注射，也可通过气管注入体内[8-10]。该模型在操作上相对简单，并且比较容易重复。但是有研究提出，内毒素模型不能准确地再现脓毒症的细胞因子表达谱[11]，即不能准确地反映人类脓毒症的复杂性，因此该模型不再被认为是准确模拟脓毒症的有效模型。

1.3 细菌感染模型

除上述内毒素模型外，还存在多种细菌感染模型。例如腹腔注射大肠埃希菌、静脉注射铜绿假单胞菌等[12-13]。许多实验通过推注或短期持续输注大剂量细菌来诱导脓毒症的模型，在这些模型中，输注细菌会导致心功能和心输出量快速、显著降低，并且实验动物可在数小时内死亡[14]。细菌可以通过静脉、气管、肌肉或腹腔等途径注射入体内。其死亡率主要取决于注射细菌的种类和菌落形成单位（CFU）的数量、注射途径、液体复苏的程度以及是否使用抗生素等。但是它们同样具有显著的缺点，因为临床脓毒症往往是多细菌性感染，即要求细菌种类的复杂多样，并且由于补体系统激活发挥快速裂解作用，大量细菌通常不会在宿主内定植和复制，因此实验所获得的只是一种潜在的内毒素中毒模型，而不是真正的多微生物感染的模型[11]。

1.3.1 呼吸道感染模型 通过向动物气管或鼻腔内注入链球菌、克雷伯菌或铜绿假单胞菌等，可诱导呼吸道感染的模型，注入细菌后，肺脏可出现弥散性损伤，肉眼可见肺肿胀、表面散在多个出血点，组织形态学观察显示有中性粒细胞聚集[14]。考虑到与脓毒症的临床病程不相符，该模型现已较少使用。

1.3.2 腹腔感染模型 诱导产生细菌性腹膜炎的方法，主要是试图再现脓毒症患者中观察到的病理生理变化[15]。脓毒症患者最常见的感染源来自腹腔，且造成腹腔内感染相对容易，因此腹腔感染模型是目前最常采用的脓毒症动物模型[16]。盲肠结扎穿刺 （CLP）模型和升结肠持续置管腹膜炎（CASP）模型是两种研究脓毒症常用的动物模型，均模仿临床腹腔感染的病理生理过程。

1.3.3 CASP模型 CASP模型是脓毒症的高度标准化模型。重现了急性多重细菌感染脓毒症性腹膜炎的发生、发展过程。其方法是将一固定管径的支架插入大鼠或小鼠的升结肠中，使肠腔与腹腔相通，持续感染导致腹膜炎、菌血症、多器官感染，以及多种促炎因子和抗炎因子的释放。该模型动物的典型症状有活力降低、毛发竖立、出汗、进食减少、体重减轻以及逃避行为减少等。其死亡率以及细胞因子的变化主要与置入支架管的管径大小有关。置入不同管径的支架，可以产生不同的死亡率。例如，置入14G支架管产生的死亡率为100%，16G导致70%死亡率，使用18G支架管可达到50%死亡率，假手术组存活率为100%。通常，动物在CASP后48 h内死亡。CASP诱导的脓毒症还表现为促炎因子、抗炎因子和趋化因子的释放，在CASP造模完成后12 h，通过酶联免疫吸附法（ELISA）可在血液中以及肝、肺、脾、肾等脏器悬浮液的上清液中检测到肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL- 10、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎性因子的大量表达。因此，在建立CASP模型时，应将生存率、细菌学和细胞因子释放等作为控制CASP正确操作的参数。CASP模型是一种易于学习且高度可重复的模型，可以模拟脓毒症的临床病程。该模型可用于免疫学、感染病学或外科学等学科领域的研究[17-18]。

1.3.4 CLP模型 CLP模型已成为实验脓毒症最广泛使用的模型，该模型非常类似于人类脓毒症的病程进展和病理生理特征，能比其他模型更准确地反映临床现实，因此目前被认为是脓毒症研究的“金标准”。CLP模型通过结扎和穿刺盲肠，制造一个盲肠穿孔的模型，肠内容物进入腹腔，多微生物感染加速诱发免疫应答，诱导产生腹膜炎、菌血症、感染性休克以及多脏器功能衰竭，最终导致死亡。影响诱导脓毒症严重程度的因素众多，包括麻醉药剂量、腹部切口长短、盲肠结扎位置、穿刺针直径大小、穿刺孔数量、液体复苏以及小鼠品系和性别等。值得一提的是，多数研究一致认为盲肠结扎位置是CLP模型中死亡率和疾病严重程度的最主要决定因素[19-21]。结论为：①结扎25%或以下的盲肠死亡率几乎为零，为轻度脓毒症；②结扎50%～60%的盲肠导致术后死亡率为60%，为中度脓毒症；③结扎75%或以上的盲肠导致小鼠在术后2～3 d内全部死亡，为重度脓毒症。而在不同程度脓毒症中，死亡主要集中在最初的48 h内。有研究通过改变盲肠结扎位置和穿刺针直径来调节脓毒症的严重程度，其中提到与结扎长度小于1 cm的小鼠相比，结扎长度超过1 cm的小鼠死亡率显著增加至100%；增加穿刺针的直径也使得存活率从100%（22G针）降低至55%（19G针）。结论为：在上述两个因素中，盲肠结扎位置比针头大小影响更为显著[20]。CLP诱导的脓毒症术后6 h即可出现菌血症，术后约12 h出现脓毒症相关临床症状，包括发热、寒战、毛发竖立、全身无力和活动减少等，术后18 h开始死亡[21]。总之，在制作CLP模型时，必须仔细考虑所有可能影响实验的条件和技术参数以获得可重复且一致的实验结果。因此，要求实验人员深入了解和熟练掌握操作过程才能准确地构建CLP模型。

1.3.5 CASP模型和CLP模型的比较 CASP模型和CLP模型所表现的疾病侧重点不同，当实验需要进行弥漫性腹膜炎的相关研究时，CASP模型优于CLP模型；而对于其他腹腔内感染如腹腔脓肿的研究，则应优先选择CLP模型[22]。

2 脓毒症体外模型

2.1 巨噬细胞

巨噬细胞在脓毒症期间对损伤作出第一反应，是宿主免疫防御的第一道防线[23-24]。巨噬细胞可产生许多细胞因子，包括促炎性细胞因子TNF-α以及抗炎性细胞因子IL-10等。机体损伤后释放的促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的平衡影响脓毒症的炎性反应程度和结局[25]。巨噬细胞在宿主抵御感染、修复组织损伤、分泌细胞因子从而调节炎性反应等方面起重要作用[26]；有文献提到，脓毒症期间的炎性反应依赖于单核细胞/巨噬细胞（如肝脏中的Kupffer细胞）上病原识别受体的激活（即Toll样受体），这是脓毒症的重要发病机制[27]。简而言之，巨噬细胞在脓毒症触发炎性反应时起重要作用，脓毒症的炎性反应过程与巨噬细胞关系密切。因此，巨噬细胞被广泛用于脓毒症的体外实验研究。较常用于脓毒症体外实验的巨噬细胞包括来源于白血病小鼠的巨噬细胞（RAW264.7）和来源于骨髓的原代巨噬细胞（BMDM）等。

2.2 单核细胞

单核细胞在脓毒症的发病机制中起核心作用[28]。脓毒症期间，单核细胞进入一种炎症激活状态，并且伴随着炎性介质的大量释放。随着炎症进展，机体逐渐进入免疫耐受状态，单核细胞从炎症激活状态到免疫耐受状态过程中呈现出不同的表型，这些表型产生细胞因子的能力也不同[29]。有研究表明，脓毒症患者单核细胞CD14、HLA-DR的表达水平与脓毒症的疾病严重程度相关[30-32]；并且严重脓毒症患者的单核细胞表面CD40和CD80的表达显著增多[32]。综上，脓毒症的病理生理学机制与单核细胞亦有着密不可分的关系。因此，单核细胞也被广泛用于脓毒症的体外实验研究。常用的有人外周血单个核细胞（PBM）和人单核白血病细胞系（THP-1）等。

2.3 内皮细胞

多个研究表明，内皮细胞参与脓毒症的发生发展过程[33-35]，并且内皮细胞在脓毒症的发病中起着重要作用。过度炎性反应和微血管功能障碍是脓毒症的重要发病机制，而内皮细胞是该过程中最重要的效应细胞[36]；脓毒症期间诱发的内皮细胞损伤在脓毒症的疾病进展过程中起着至关重要的作用，并且内皮细胞损伤的严重程度与脓毒症的预后密切相关[37]；Zahran等[38]也提到，脓毒症期间伴随着广泛的内皮损伤，随后循环中出现内皮细胞，从而脓毒症患者的循环内皮细胞和循环内皮祖细胞（EPC）表达显著增多，并且内皮细胞的表达水平与脓毒症的疾病严重程度和预后有关。因此内皮细胞也是脓毒症体外实验研究的常用载体。例如，人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）和人肺微血管内皮细胞（HPMEC）等。

2.4 其他细胞

树突状细胞（DC）是一种重要的抗原提呈细胞，在脓毒症的免疫应答中发挥着重要作用[39]；脓毒症和脓毒性休克伴随着多个器官和组织的损伤，病程中可诱导成体干细胞的再生，因此也有研究分析造血干细胞（HSC）、EPC和极小胚胎样干细胞（VSEL）等在脓毒症过程中所发挥的作用[40]；还有研究以原代肝细胞为载体证明某蛋白激酶能够减轻脓毒症肝损伤[41]。根据不同的研究内容，研究者会选择不同的细胞作为载体。

3 存在的问题

Dejager等[42]研究发现，根据脓毒症动物实验获得的有效结果所提出的数种疗法无法完全应用于临床，这表明实验性脓毒症模型还不能完全模拟人类脓毒症。所有脓毒症模型在临床相关性方面有2个共同的缺点：① 缺乏疾病发展所需的时间，构建实验脓毒症模型时都是要求可再现和快速的疾病过程。例如，在大多数实验模型中，出现脓毒症的炎性反应以及发展为多脏器功能衰竭发生在数小时至数天内，而在临床患者中，脓毒症的疾病发展往往需要数天至数周；② 缺乏干预治疗，临床上会给患者加用各种标准疗法去迅速治疗脓毒症，例如氧疗、机械通气、液体复苏、抗生素、血管加压药以及营养支持等[43]。美国加州大学医学院在脓毒症动物模型研究方面曾提出：“这些临床前研究的结果永远不应该直接运用到人类脓毒症问题上”[44]。鉴于这些因素，将由脓毒症模型所得疗效结果应用到临床时，要求我们谨慎处理。

综上所述，体内腹腔感染如CLP模型和体外巨噬细胞为载体的脓毒症模型分别是目前较为常用的脓毒症体内和体外实验模型。除此以外，研究者也可根据具体研究内容的不同选择其他的造模方式。脓毒症模型的改进可提高我们定义适当目标人群的能力，以便于更准确、更低成本地去进行有关脓毒症治疗的临床试验研究。最后，尽管仍存在缺点，但脓毒症模型为深刻理解脓毒症时宿主对感染的免疫反应及炎性介质的作用作出了重要贡献。脓毒症的动物模型和体外细胞模型仍将是评估脓毒症新治疗策略最合适的工具。模型越接近于人类疾病，所得结果就越可靠。因此，如何缩小实验性脓毒症模型与临床人类脓毒症之间的差距，是需要我们共同面对和处理的问 题。