Toll样受体激动剂在辐射防护方面的研究进展

郭 娇，杨海玉，龙 伟

中国医学科学院 北京协和医学院 放射医学研究所药物室，天津300192

电离辐射直接作用或产生活性氧，使细胞中的DNA、蛋白质等生物大分子发生结构和功能变化，进而导致细胞凋亡和坏死，对增殖旺盛的器官影响尤为严重[1]。当受到大于1 Gy的高剂量率辐射后机体会发生急性辐射综合症，临床上主要表现为造血系统和胃肠道功能障碍[2]。目前临床上可用的辐射防护剂很少，基于抗氧化原理研发的阿米福汀安全窗窄、不良反应严重，细胞因子疗法作用单一、易致癌，中药治疗作用靶点不明确、可控性低，使其在临床上的应用受到限制，迫切需要开发高效低毒的辐射防护剂[2-4]。2008年，Burdelya等[5]基于肿瘤细胞的抗凋亡机制，发现了一种Toll样受体 （Toll-like receptor，TLR）5的激动剂，通过激动TLR5激活下游的核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），进而减少受照小鼠、恒河猴体内骨髓和胃肠道的细胞凋亡，提高受照小鼠和恒河猴的存活率，相比其他已有辐射防护剂，辐射防护效果更好、不良反应更低。自此，TLR激动剂在辐射方面的应用开始成为研究的热点。

TLR及其产生辐射防护的机制

TLR是一类模式识别受体，是哺乳动物先天免疫系统的一部分，能识别病原相关分子模式 （pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）或宿主来源的损伤相关分子模式 （damage-associated molecular patterns，DAMPs）。识别PAMPs/DAMPs后，TLR的胞内区发生构象改变，从而募集一系列含有Toll/白介素 （interleukin，IL）-1受体结构域的胞内接头蛋白，如髓样分化因子 88 （myeloid differentiation factor 88， myd88）、诱导干扰素-β（interferon-β， IFN-β） 包含 Toll/白介素1受体结构域的接头分子，然后启动下游信号传递，包括NF-κB、促分裂原活化蛋白激酶和干扰素调节因子，进而促进DNA损伤修复基因表达、抗氧化和抗凋亡相关细胞因子表达、干扰素上调等，从而能对抗辐射后的DNA损伤、细胞凋亡和继发感染[2，4，6-7]。1996年，Lemaitre等[8]首次在果蝇中发现了该类受体。目前，已经报道了10种人类TLR（TLR1-TLR10）和12种小鼠 TLR（TLR1-TLR9和 TLR11-TLR13）。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10位于质膜中，可识别微生物细胞壁和细胞膜成分，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9主要位于细胞内的隔室中，可识别核酸配体[9]。

TLR2和TLR4

TLR2和TLR4都表达在细胞膜表面，通过形成二聚体参与配体的识别。

TLR2与TLR1、TLR6定位于4号染色体，在外周血白细胞中高表达，其信使RNA在单核/巨噬细胞中表达颇丰[10]。TLR2能够分别与TLR1或TLR6形成异源二聚体，识别其配体，TLR2/6在辐射防护方面的研究比TLR1/2多[6]。对TLR2/6激动剂的研究始于支原体脂肽，基于其起作用的N端结构，先后人工合成的脂肽有 CBLB601、CBLB612、CBLB613。CBLB613剂量减少因子 （为1.25）高、给药窗宽、给药剂量低和免疫原性低，与CBLB601、CBLB612相比，具有更高的辐射防护活性、更低的毒性[2，11-12]。CBLB613刺激粒细胞集落刺激因子 （granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IL-6、角质细胞趋化剂等细胞因子大量分泌，促进骨髓造血细胞和外周血细胞的恢复，照射前24 h或12 h和照射后6 h或1 h单次给药0.015 mg/kg，受9.2 Gy60Coγ射线照射的CD2F1小鼠的30 d存活率均为100%[12]。与CBLB613结构相似的合成成纤维细胞刺激脂肽也通过激动TLR2/6产生辐射防护作用，其比平行实验的其他几种TLR的激动剂更高效，是副作用最小的TLR2激动剂[13]。Chen等[14]发现另一种激动TLR2的微生物，热杀伤结核分枝杆菌，增加CD34+造血干细胞的数量，减轻受照小鼠骨髓和睾丸的辐射损伤，令人感兴趣的是它能降低炎症相关因子的表达，使Th1/Th2趋于平衡，抑制炎症反应的发生。另外，一些微生物的细胞壁成分也被报道通过激动TLR2产生辐射防护作用，如肽聚糖在增强放疗诱导的抗肿瘤作用和减少放疗对肠道的不良反应方面具有临床相关性[15]，一种从酵母细胞壁中提取的多糖酵母聚糖-A促进了受照小鼠造血系统的恢复[16]，鼠李糖乳酸杆菌释放的脂磷壁酸保护肠上皮细胞免受辐射损伤[17]。

TLR4位于9号染色体，通过与自身形成同源二聚体识别其配体[6]。人们对TLR4的研究较早[18]，但其在辐射防护方面的研究晚于TLR5。2013年，Liu等[19]发现敲除TLR4的小鼠对辐射更加敏感，将脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS）注射到正常小鼠体内，可在体内激动TLR4以myd88依赖的方式激活NF-κB，减轻受照小鼠的辐射损伤。然而LPS毒性严重，限制了其临床应用，单磷酸脂质A是一种低毒的TLR4激动剂，其能保护骨髓，减轻辐射对脾脏和免疫失调的损害，使睾丸和肠道免受辐射损伤[20]。Xu等[21]发现热灭活的鼠伤寒沙门氏菌 （heat-killed salmonella typhimurium，HKST）以TLR4依赖的方式保护小鼠免受辐射损伤。HKST实质上是一种TLR2、TLR4和TLR5的协同激动剂，TLR2和TLR4识别HKST细胞壁成分，如肽聚糖和LPS，TLR5识别细胞外鞭毛蛋白，其显著抑制辐射诱导的DNA损伤和细胞凋亡，减轻小鼠骨髓、肠道、睾丸、脾脏和肺的辐射损伤，并且抑制辐射所致的Th1向Th2的转变，阻止炎症反应的发生，提高受照小鼠的存活率[21-22]。

多种TLR2和TLR4的激动剂均已在动物水平被证明在辐射前后给药均有效，且优于已被FDA批准的阿米福汀和G-CSF，它们免疫原性低，不会引起炎症反应，相比TLR5在体内广泛表达，且由于协同激动作用，给药剂量小，可与CBLB502相媲美且有可能突破CBLB502的组织局限性，具有很大的临床应用潜力。另外，虽然CBLB612（H6101）与辐射防护相关的文章还没有发表，但查到的资料显示克利夫兰生物实验室已经完成Ⅱ期临床研究，用于接受阿霉素-环磷酰胺化疗的乳腺癌患者的骨髓抑制预防 （https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02778763）。

TLR5

TLR5位于1号染色体，表达受限制，主要在肠道、肝脏和膀胱。2008年，Burdelya等[5]基于肿瘤细胞的抗凋亡机制，发现TLR5的激动剂CBLB502（恩托莫德）具有辐射防护作用，其是一种经过药理优化的沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物。CBLB502通过激动TLR5以myd88依赖的方式激活NF-κB，可诱导快速而短暂地产生高水平的G-CSF、IL-6、IL-8和IL-10等抗凋亡的细胞因子，而肿瘤坏死因子-α、IL-1β和IL-2等促炎因子的表达处于低水平，其也能促进抗氧化因子超氧化物歧化酶2的表达。CBLB502不仅保护肠道固有层和隐窝细胞，也保护骨髓造血干细胞和早期祖细胞。13 Gy全身照射 （total body irradiation， TBI） 前30 min按0.2 mg/kg给小鼠注射CBLB502可使存活率达到87%，此照射剂量下阿米福汀的有效给药剂量已接近最大耐受剂量。对9 Gy的TBI，CBLB502照射前24 h和照射后1 h给药均起效。另外，CBLB502对局部辐射损伤也有效，对头颈部肿瘤放疗的小鼠模型的上皮损伤有缓解作用，也可以改善辐射所致的小鼠睾丸损伤。并且CBLB502不会使肿瘤细胞的放射敏感性降低，也不会因为抑制细胞凋亡而提高癌症的发生率，同时实验证明其不会产生耐受性。CBLB502相比其他已有辐射防护剂，辐射防护效果更好、不良反应更低[5，23-25]。肝脏是CBLB502发挥辐射防护作用的中心，是CBLB502作用的主要靶器官，被激动后会激活多种促生存和免疫调节信号通路，并使分泌因子谱和免疫细胞含量发生显著变化，造血祖细胞的辐射保护也依赖于肝细胞分泌的因子[26]。虽然鞭毛蛋白的毒性远大于CBLB502，但同年Vijay-Kumar等[27]证实鞭毛蛋白在照射前2 h至照射后4 h给药均可产生辐射防护作用。通过建立TLR5介导的NF-κB筛选模型，再与鞭毛蛋白的作用对照，发现聚乙烯亚胺 （polyethylenimine，PEI）通过激动TLR5产生辐射防护作用。PEI的作用机制与鞭毛蛋白非常相似。然而，由于相对分子质量比鞭毛蛋白小，PEI可能比鞭毛蛋白具有更高的药理特异性、更低的有效剂量、更容易到达靶点、更便于保存[28]。研究者们对CBLB502做了很多改造，以求得到更加高效低毒的辐射防护药物。2016年，胡显文等[29]获得CBLB502-Fc融合蛋白及其制备方法的专利，该融合蛋白包括CBLB502蛋白和免疫球蛋白Fc片段，活性高、稳定性好、半衰期长。2019年，报道了一种新型TLR5激动剂KMRC011在致死性辐射小鼠中具有辐射保护活性，其本质是CBLB502的修饰物，利用泛素特异性蛋白酶，选择性地将34个可以引起免疫应答的氨基酸残基从CBLB502中剪切出来而得[30]。此外，也报道了一些植物药通过激动TLR5产生辐射防护作用，如植物凝集素-L蛋白[31]和黑茶提取物[32]。

TLR5激动剂是在辐射防护方面研究最早的，且CBLB502是唯一一个被FDA授予研究新药 （investigational new drug，IND）地位的TLR激动剂，进入FDA批准的快速通道，已完成Ⅱ期临床研究，有望成为上市药物应用于头颈部肿瘤放射治疗的辐射防护[2，33]。

TLR7、TLR8和TLR9

TLR7和TLR8均位于x染色体，TLR9位于3号染色体，三者高度同源，与其他报道的TLR成员不同，它们是在基因组数据库中确定的[34]。它们主要在细胞内的囊泡表达，如内质网、内涵体、溶酶体和内溶酶体。除了能够识别含有DNA及RNA的自身抗原外，TLR7和TLR8可识别外源单链RNA病毒和小分子咪唑并喹啉衍生物，TLR9能识别DNA来源的DNA病毒和细菌[6]。TLR7激动剂可作为肿瘤放射治疗的佐剂，放疗联合TLR7激动剂与单纯放疗相比，提高了淋巴瘤模型小鼠的存活率。与TLR4和TLR9的激动剂相比，TLR7的激动剂更有效地促进DC和NK细胞向小鼠淋巴结中聚集并诱导CD4+和CD8+效应T细胞生成，增强Th1型细胞免疫反应的能力。其中TLR7激动剂均是小分子咪唑并喹啉衍生物，有瑞喹莫德、咪喹莫特和TMX-101。TLR8在辐射防护方面的应用报道较少，但瑞喹莫德同时激动TLR7和TLR8[35-36]。CpG-寡脱氧核苷酸 （CpG-oligodeoxynucleotides，CpG-ODN）作为一种合成的类似细菌DNA的物质，被证明可通过激动TLR9产生辐射防护作用，可使TBI引起的骨髓损伤减轻，重建造血功能，提高受照小鼠的存活率[37]。为了提高CpG-ODN的活性和靶向性，可以考虑将其包装成纳米颗粒。Kobiyama等[38]生成了一种新的纳米连接的K型 CpG-ODN（K3），它由非激动性的树突状细胞相关性C型植物凝集素-1配体裂裥多糖包裹，即K3-裂裥多糖，在免疫治疗中显示更高的辅助活性，但在辐射防护方面报道较少。目前，TLR7、TLR8、TLR9在辐射防护方面的研究较少，以后可以做出更多尝试。

综上，本文对在辐射防护方面已有研究的TLR的激动剂进行了梳理和讨论，表明TLR激动剂是最有潜力的辐射防护剂。电离辐射对人体造成的损伤是不容忽视的，然而由于国防、工业和医疗的需要，部分人群可能会受到电离辐射。被批准用于临床的只有阿米福汀和G-CSF，而阿米福汀安全窗窄、仅辐射前给药有效，严重时会造成呕吐、一过性低血压和昏迷，G-CSF作用单一、需多次注射，并会引起骨髓增生和败血症[1-2，4，33]。本文综述的各种TLR的激动剂均较二者显示了更高的优越性，照射前后给药均有效且给药窗宽，CBLB502照射前24 h和照射后1 h给药均起效[5]，CBLB613照射前48 h至照射后6 h给药均起效[12]。TLR激动剂还能诱导高水平的辐射防护相关细胞因子的短暂升高，如G-CSF和IL-6，这些细胞因子促进骨髓造血细胞、外周血细胞的再生，升高外周血细胞如白细胞、血小板等的最低值，缩短外周血细胞低于正常值的持续时间。TLR激动剂也诱导抗氧化细胞因子的产生。有趣的是，TLR激动剂不会引起促炎细胞因子高表达，并抑制辐射所致的Th1向Th2的转变，阻止炎症反应的发生。另外，虽然TLR激动剂的辐射防护作用是基于肿瘤细胞的抗凋亡机制被发现的，但却不会降低肿瘤细胞的放射敏感性，也不会增加癌症的发生率。在辐射防护方面，CBLB502是唯一一个具有IND的TLR激动剂，但由于对其研究既基于靶点也基于表型，所以相较另外7个具有辐射防护作用的IND药物更具潜力，目前已完成Ⅱ期临床研究，有望成为上市药物应用于头颈部肿瘤放疗的辐射防护[33]。为了研究更加高效低毒的辐射防护剂，TLR协同激动剂将成为一个重要的研究方向。