壳聚糖季铵盐的制备及抑菌性能研究

包艳玲（武汉轻工大学，湖北武汉430000）

0 引言

无论是壳聚糖还是壳聚糖季铵盐，其分子量都是影响其抗菌活性的重要因素。据报道，壳聚糖的分子量在104～105之间，有利于抑制细菌的生长。程国军等人发现壳聚糖分子量为2.2 x 104时，其抗菌活性较高。Tokura 等人发现平均分子量9.3 x 103的壳聚糖对大肠杆菌有抑制作用，而分子量为2.2 x 104的壳聚糖能促进大肠杆菌生长。目前，关于CTS-QTS的性能还没有一个统一的结论，存在很多争议。

以壳聚糖衍生季铵盐抗菌剂是壳聚糖衍生物研究的热点，但目前对壳聚糖及其季铵盐衍生物的抗菌机理的研究还不深入，而进一步提高抗菌性能，必须以全面、深层次认识其抗菌机理为基础。从化学结构方面来看，含吡啶的季铵盐、双季铵盐等具有更高杀菌活性，与壳聚糖反应，有望制得具有更好抗菌效果的壳聚糖衍生物抗菌剂。

HACC 作为一种高分子聚合物，具有良好的抗菌抑菌、保湿、易溶等性能，因此可作为瘢痕及创伤修复、抗感染、调脂、载药及药物控释等产品应用。而HACC 的这些性能与CTS 的季铵化改性有着密切的联系，但人们对于这种关联的研究目前还不是很深入，为进一步提高HACC 的扩展应用，有必要加大对CTS 季铵化的了解和探究，以便提高和改善HACC的性能。

由于壳聚糖分子中存在氨基和羧基使得壳聚糖易于进行物理和化学改性，可以引入例如环氧乙烷、乙酸、二硫化碳等化学物质对其进行改性，以改善其物理和化学性质。铵与卤代烃反应可以制取季铵盐，季铵盐易溶于水且具有较强的抗菌性，因这一性能被广泛用于各种化合物改性中。目前季铵盐类消毒剂在医疗卫生领域、生物制剂领域以及农业领域中都被广泛应用。利用季铵盐对壳聚糖进行改性，若两者结合既能保留季铵盐易溶于水的特性又能增强两者都具有的抗菌性能，就会有更广阔的应用前景。

本实验以环氧丙基三甲基氯化铵为原料，在壳聚糖的氨基上发生加成反应生成了壳聚糖季铵盐。研究不同条件对壳聚糖季铵盐合成效果的影响，研究了壳聚糖季铵盐对大肠杆菌的抗菌性能。

1 实验过程

1.1 合成壳聚糖季铵盐

首先进行过滤，检查装置气密性；然后把滤纸修剪成合适的大小，最好与布氏漏斗大小相似而略小于布氏漏斗。倒入适当的蒸馏水使滤纸与布氏漏斗完全贴合住，打开抽滤泵开关开始抽滤，将ph为7左右的壳聚糖溶液倒入布氏漏斗进行抽滤得到白色胶状物，放入250ml圆底烧瓶中备用；

在45～85℃下以不同摩尔比加入环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)，再加入100ml异丙醇。然后在恒温搅拌4～10小时。由于异丙醇沸点较低，所以采用回流装置。反应结束后，在混合溶液中加入适量丙酮使产物沉淀。沉淀物先进行抽滤，后用甲醇洗涤、抽滤，最后用丙酮-乙醇混合溶液(体积比为4：1)洗涤、抽滤。然后把设置烘箱温度为120℃，在空气干燥箱中放置12小时，干燥后得到壳聚糖季铵盐。

1.2 检测温度对壳聚糖季铵盐合成的影响

开启恒温加热磁力搅拌器，搭建冷凝回流装置，分别在55、65、75 和85℃条件下进行反应，在上述圆底烧瓶中加入环氧丙基三甲基氯化铵15g，再加入100ml异丙醇，恒温搅拌8小时。

1.3 检测不同摩尔比对壳聚糖季铵盐合成的影响

打开恒温加热磁力搅拌器，设定温度为75 摄氏度，搭建冷凝回流装置，待升温至75℃后在上述圆底烧瓶中分别加入环氧丙基三甲基氯化铵5g、10g、15g、20g，再加入100ml异丙醇，恒温搅拌8小时，研究CTS与GTA的不同摩尔比对产物的影响。

1.4 壳聚糖季铵盐的抗菌性能检测

（1）培养基的配置：将将10 g 蛋白胨、5 g 牛肉膏、5 g 氯化钠、20 g 琼脂粉加入到1000 mL 蒸馏水中，充分混合后调节培养基的pH 值至7.0 ～7.2，加热充分溶解，于121 ℃下高温灭菌20min；

（2）倒平板：在超净工作台下将灭菌后的混合溶液倒入平板中，等待冷却，制成固体培养基；

（3）冷却后翻转平板，在平板上画线，分四个区域；

（4）在超净工作台上把大肠杆菌用移液枪放入平板中，用涂布棒进行涂布，涂布要均匀、充分，在酒精灯下进行涂布操作；

（5）涂布完成后，用灭菌过的移液枪吸取适量样品于平板中的指定区域内；

（6）把平板倒扣放入生化培养箱中培养12 小时后，观察样品的抑菌情况。

2 结果分析

2.1 分析不同条件对壳聚糖季铵盐合成的影响

2.1.1 温度对壳聚糖季铵盐合成的影响

反应时间定为8h，CTS与GTA的摩尔比定为1：3，测量不同温度对壳聚糖季铵盐合成的影响

结果显示，随着反应温度不断提高，壳聚糖季铵盐的溶解度也随之增大，但这种线性关系到75℃之后开始改变，75 摄氏度时壳聚糖季铵盐溶解度达到最大，而继续升高反应温度，壳聚糖季铵盐溶解度呈下滑趋势，分析其原因可能是温度过高，导致了壳聚糖季铵盐的分子链发生裂解，从而导致壳聚糖季铵盐的溶解度降低。而且反应温度过高可能会使环氧丙基三甲基氯化铵中的环氧键发生断裂，GTA分子之间可能发生了交联反应，使得相对较少的GTA 分子与壳聚糖发生反应，导致壳聚糖季铵盐的合成较少。从而溶解度降低。故选择反应温度75℃为宜。

2.1.2 壳聚糖与环氧丙基三甲基氯环的不同摩尔比对壳聚糖季铵盐合成的影响

反应时间定为8h，温度定为75摄氏度，测量壳聚糖与环氧丙基三甲基氯环的不同摩尔比对壳聚糖季铵盐合成的影响。结果显示，随着壳聚糖与环氧丙基三甲基氯环的摩尔比不断增加，壳聚糖季铵盐的溶解度也不断增加，但当壳聚糖与环氧丙基三甲基氯环的摩尔比大于3时，壳聚糖季铵盐的溶解度增加缓慢趋于稳定，最终不再增加。故选择CTS 与GTA 的摩尔比为1：3。

2.1.3 壳聚糖季铵盐的抑菌性能分析

第一次抑菌试验采用75℃下反应6 小时，CTS 与GTA 摩尔比为1：1 的壳聚糖季铵盐进行检测，壳聚糖季铵盐溶液浓度为0.03%，用滤膜浸染季铵盐壳聚糖溶液放入平板内，用报纸把平板包好，放入生化培养箱培养12小时后观察实验结果.

我们可以看出，浸染了壳聚糖季铵盐溶液的滤膜上有菌产生但是很少量，而没有侵染溶液的滤膜与空白对照处都长满了大肠杆菌，证明0.03%壳聚糖季铵盐溶液有抑菌效果但抑菌效果不好，分析可能是因为溶液浓度过低而导致抑菌效果不明显。

第二次抑菌实验采用了75℃下反应6 小时，CTS 与GTA 摩尔比为1：1的壳聚糖季铵盐进行检测，壳聚糖季铵盐溶液浓度为0.05%，用灭菌过的移液枪向平板内滴加壳聚糖溶液、0.05%壳聚糖季铵盐溶液和0.05%环氧丙基三甲基氯化铵溶液，放入生化培养箱培养12小时后观察实验结果.

可以看出，左上角滴加壳聚糖溶液的部分有明显的抑菌圈出现，证明壳聚糖溶液具有良好的抑菌效果；而右上角滴加0.05%壳聚糖季铵盐溶液的部分也有抑菌圈出现，但抑菌圈较小且不是特别明显；左下角的0.05%环氧丙烷三甲基氯化铵溶液与右下角空白对照组相同，平板上均长满了大肠杆菌，证明环氧丙基三家基氯化铵完全没有抑菌性。

第三次抑菌实验的壳聚糖季铵盐的反应条件为：反应温度为75℃，反应时间为8h，CTS与GTA 摩尔比为1：3，称取3g样品与100ml水中充分溶解，配置3.00%的壳聚糖季铵盐溶液，进行实验.

平板中分为四片区域，上方是环氧丙基三甲基氯化铵溶液，下方为无任何溶液滴加的空白对照组，平板左边为壳聚糖溶液，右边为3.00%的壳聚糖季铵盐溶液。我们可以明显的看出，滴加环氧丙基三甲基氯化铵处的平板长满了大肠杆菌，证明其毫无抑菌效果。而壳聚糖溶液与壳聚糖季铵盐溶液均有抑菌效果，且滴加壳聚糖季铵盐溶液处的平板抑菌圈较大，抑菌效果相对明显，滴加壳聚糖季铵盐溶液的部分已完全没有菌生长。较之前的两次实验相比较，我们可以发现，壳聚糖季铵盐的浓度对抑菌效果影响较大。

3 结语

文章以壳聚糖为研究对象，用环氧丙基三甲基氯化铵作为化学改性剂对壳聚糖进行改性，反应生成壳聚糖季铵盐。研究反应温度、反应时间、壳聚糖与环氧丙烷三甲基氯化铵的不同摩尔比对壳聚糖季铵盐合成的影响，最后检测不同浓度不同条件合成的壳聚糖季铵盐的抑菌效果。通过研究，结论如下：

温度对壳聚糖季铵盐合成的影响较明显，随着温度的升高，壳聚糖季铵盐的溶解度不断提高，反应温度为75摄氏度时溶解度达到最高，但再升高温度壳聚糖季铵盐分子链就会发生降解，溶解度开始下降。随着反应时间不断增加，壳聚糖季铵盐的溶解度也随之增大，反应时间达到8小时时壳聚糖季铵盐溶解度达到最大，反应基本完全，反应8小时以上溶解度基本无变化。CTS与GTA的摩尔比为1：3时二者反应基本完全。壳聚糖与壳聚糖季铵盐均有抑菌效果。随着溶液浓度升高，抑菌效果越来越明显。